生物技术药物制剂

一、基本概念

生物技术或称生物工程，是应用生物体(包括微生物、动物细胞、植物细胞)或其组成部分(细胞器和酶)，在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程，此外还有发酵工程(微生物工程)与生化工程。生物技术药物是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，也称为生物技术药物。

近十几年来，生物技术在医药方面取得了惊人的成就，已有不少生物技术药物应用于临床，下面介绍一些国内外已批准上市或正在研究的生物技术药物产品。

(一)生物技术药物的研究概况

生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约数几十种，正在研究的有数百种之多，部分正在研究或已经上市的生物技术或其他来源的药物列于下表中，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。

部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物
药物	作用与用途
血管紧张素D抑制剂	降压
心房肽激素	调节心血管功能
降钙素基因相关因子	血管舒张药
β-内啡肽	镇痛
神经生长因子，hNGF	刺激神经生长和修复，痴呆
促胃液抑制剂	减少胃酸分泌
部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物
药物	作用与用途
脑啡肽	刺激淋巴细胞母细胞化
促胸腺生成素	选择性T细胞分化激素
表皮生长因子，hNGF	促进表皮生长，痴呆
生长抑素	抑制胃蛋白酶分泌
促性腺素	促进排卵、精子生成
促黄体生成素释放激素（LHRH）	促进下丘脑性闭经妇女排卵
表 2-1-11 部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物
药物	作用与用途
缩宫素	促进分娩
促甲状腺激素释放激素（TRH）	延长哺乳期妇女的不育和泌乳
加压素	治疗尿崩症
人尿激酶原	溶血栓，抗凝剂
人超氧化物歧化酶	肾移植，烧伤
白细胞介素-6	肿瘤、骨髓移植，刺激造血
白细胞介素-11	促血小板生成
部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物
药物	作用与用途
链激酶，LSK	溶血栓
人成纤维细胞生长因子	神经损伤
人胰岛素生长因子	侏儒症
肝细胞生长因子	重型肝炎
肝癌单克隆抗体	肝癌
乙肝单克隆抗体	乙肝
反义寡聚核苷酸	HIV感染和艾滋病
部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物
药物	作用与用途
TK载体产生细胞	脑癌
巨核细胞与发育因子	刺激血小板生成
脂质体包被 IL-2，OTX-287	肿瘤
抗CD20基因工程抗体	B细胞淋巴瘤

表中所列药物，如促黄体生成素释放激素类似物、加压素等，采用提取或其他方法生产，已在临床上使用。

随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带来了新的挑战。由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性质很不稳定，极易变质，因此，如何将这类药物制成安全、有效、稳定的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。例如降钙素基因相关肽是治疗高血压的有效药物，但该药物很不稳定，虽然早已开发，但由于存在以上问题，至今未形成产品。

另一方面这类药物对酶敏感又不易穿透胃肠黏膜，故只能注射给药，使用很不方便。因此，运用制剂手段将这类药物制成口服制剂或通过其他途径给药，以提高其稳定性和患者使用的顺应性，是一项非常有意义的工作，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景。

(二)生物技术药物的结构特点与理化性质

生物技术药物多为多肽类及蛋白质类药物，这些药物的化学结构相当复杂，理化性质也有它的特殊性，因此，在设计与评价这类药物的给药系统时必须首先了解其结构特性与理化性质。

1.蛋白质的结构特点

(1)蛋白质的组成和一般结构：蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质分子量很大，一般在5×103～5×106。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等。

组成蛋白质的氨基酸有20多种，一个氨基酸的羧基可以和另一个氨基酸的氨基缩合失去1分子水而生成肽，两个氨基酸缩合成的肽称为二肽，由十个以上氨基酸组成的肽称多肽。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。蛋白质多肽链中许多氨基酸按一定的顺序排列，每种蛋白质都有特定的氨基酸排列顺序。蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构。一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置;二、三、四级结构为高级结构或空间结构。高级结构和二硫键对蛋白质的生物活性有重要影响。

(2)蛋白质的高级结构：蛋白质的高级结构包括二级、三级与四级结构。二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有α-螺旋结构与β-折叠形式。三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合方式系一条多肽链中所有原子的空间排布。四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质。

四级结构可以由两个以上的小亚基聚合而成。所谓亚基，就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价键相连，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位(亚基)。

蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、离子键、范德华力、二硫键与配位键。

除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。蛋白质分子二级结构中α-螺旋、β-折叠的形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。疏水作用力也称疏水键，疏水键是两个疏水基为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构方面起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。范德华力对稳定和维持三级、四级结构十分重要。

离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸成分通过配位键组成。

2.蛋白质的理化性质

(1)蛋白质的一般理化性质：蛋白质的分子量，小的有几千，如胰岛素(单体6000);大的上千万，如斑纹病毒(烟草)(6×107)。蛋白质在水中形成亲水胶体，颗粒大小在1～100nm之间。它不能透过半透膜。由于蛋白质分子中存在极性基团如-NH3+、-COO-、-NH2、-OH、-SH等，可形成水化层而稳定。

1)旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。

2)紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收，氨基酸在紫外230nm显示强吸收。

3)蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的ε-氨基，谷氨酸的γ-羧基等。这些基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或两性离子。

(2)蛋白质的不稳定性：蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要。引起蛋白质不稳定的原因很多，如前所述，共价键与非共价键的破坏与生成均可引起蛋白质类药物的不稳定。

1)由于共价键引起的不稳定性：共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。有时几种反应同时进行。虽然大多数降解过程在升高温度时发生，但是蛋白质稳定性监测数据表明其降解过程不符合Arrhenius关系，故蛋白质类药物稳定性的加速实验中应慎重选择其最高温度。

如白细胞介素-1β在溶液中高于和低于39℃时存在不同的失活机制，此实例排除了从加速温度数据预测处方有效期的可能性。但文献报道，组织溶纤酶原激活素在40℃和40℃以下的稳定性研究中成功地将数据外推到5℃。

蛋白质的降解途径有：①蛋白质的水解：蛋白质可被酸、碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐渐变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解与不完全水解。完全水解是在5.7mol/L盐酸中，于110℃高温20小时可完全变成氨基酸。在此条件下，能使色氨酸破坏，谷氨酰胺变为谷氨酸，天冬酰胺变为天冬氨酸，后两者的水解作用也叫脱酰胺作用。

酸水解可使胱氨酸变成半胱氨酸，丝氨酸、苏氨酸也有不同程度的破坏。不完全水解是在酶或稀酸等较温和的条件下进行，水解产物有肽段与氨基酸。蛋白质在4.2mol/LNaOH溶液中水解10小时，使蛋白质完全水解，碱水解对半脱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等有破坏作用，同时使各种氨基酸发生消旋。

②蛋白质的氧化：蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸可以在一些氧化剂的作用下氧化，甲硫氨酸可氧化成甲硫氨酸亚砜而使一些多肽类激素和蛋白质失去活性。半胱氨酸的巯基根据不同的反应条件，可依次氧化为次磺酸(RSOH)、二硫化物(RSSH)、亚磺酸(RSO2H)，最后成磺酸(RSO3H)、半胱氨酸，即半胱磺酸。影响氧化的因素有温度、pH、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度等。巯基的氧化在碱性条件下，特别是在金属离子(如Cu2+)的存在下容易发生。

③外消旋作用：某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50%的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH、离子强度和金属离子螯合作用。蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式。

④二硫键断裂及其交换：二硫键(-S-S-)又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键。它是由两个半胱氨酸侧链上的-SH巯基脱氢相连而成。二硫键把同一肽链(肽链内)或不同肽链(肽链间)的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。在某些蛋白质中，二硫键一旦被破坏，蛋白质的生物活性即丧失，蛋白质分子中二硫键数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强。

蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。二硫键交换可由硫醇类催化。有人证实，核糖核酸酶在90℃加热去活化作用就是二硫键交换所致，这个过程由于硫醇类物质(如半胱氨酸)的存在而加速。

2)由非共价键引起的不稳定性：引起蛋白质不可逆失活作用的有下列主要类型，即聚集、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起，这些现象在开发蛋白质与多肽类药物制剂中常会带来许多困难。

3.蛋白质类药物的评价方法

(1)液相色谱法：是评价蛋白质的纯度与稳定性的常用方法。在蛋白质分析中通常采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、离子交换色谱法(IEC)与分子排阻色谱法(SEC)。

反相色谱法是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的分析方法，对于大分子蛋白质，以C4或C8烷基键合于硅胶上或聚合物担体上作固定相，固定相应有较宽范围的孔体积(直径约300nm或更大)，以便分子量约为5000或更大的蛋白质能够充分扩散到固定相骨架中。流动相一般用不同浓度的乙腈水溶液，并含有离子对试剂，如三氟醋酸(0.1%)、磷酸盐或氨丁三醇缓冲液用以调节pH以获得最佳分离效果。

应用反相HPLC法，由于有机溶剂、疏水的相互作用及分离时所用的低pH，会使一些蛋白质变性。然而该方法对几种蛋白质特别有用，并被广泛应用于胰岛素制剂的质量分析。药典中胰岛素一般用生物效价法测定，因此在使用时应建立RP-HPLC与生物效价法之间的相互关系。RP-HPLC还应用于疟疾蛋白抗原、白细胞介素-2、突变蛋白、人生长激素及重组人体干扰素制剂稳定性的检测。

离子交换色谱法用于从N-末端甲硫氨基型分离重组白介素-1β。分子排阻色谱可以测定γ-干扰素、白介素-2在升温贮存、机械搅拌后及快速冰冻熔化后的聚集情况。

(2)光谱法：通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外(UV)、可见吸收光谱、旋光色散(0RD)、圆二色谱(CD)、荧光、红外 (IR)和拉曼(Raman)光谱。

(3)电泳：电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷及其大小的函数，以此来分离混合蛋白质。在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦和新的毛细管电泳法。

(4)生物活性测定与免疫测定：重组DNA和杂交瘤技术产品应进行生物活性的测定，蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性。生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量(或浓度)效应曲线进行定量(绝对量或比活性单位)。用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的相关性。生物活性测定是制订这类药物制剂质量标准的最基本方法。

免疫测定通常是采用免疫化学法，这种方法也可作为蛋白质结构研究的辅助手段。与其他方法相比较，主要优点是可用于定量化学分析不能检测的情况，例如测定蛋白质混合物的一种组分。

蛋白质类药物制剂

蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题。对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺，而非注射给药还需解决生物利用度问题。本节主要讨论这类药物的注射剂型。

(一)蛋白质类药物制剂的处方工艺

目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂。溶液型使用方便，但需在低温(2～8℃)下保存。冻干粉型比较稳定，但工艺较为复杂。

1.液体剂型中蛋白质类药物的稳定化在液体剂型中蛋白质类药物的稳定化方法分为两类：①改造其结构;②加入适宜辅料。通过加入各类辅料，改变蛋白类药物溶剂的性质是药物制剂中常用的稳定化方法。蛋白类药物常用的稳定剂有：

(1)缓冲液

(2)表面活性剂

(3)糖和多元醇

(4)盐类

(5)聚乙二醇类

(6)大分子化合物

(7)组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等

(8)金属离子

2.固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺

蛋白质类药物的非注射给药存在生物利用度低等问题，因此目前多以注射途径给药。在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺使形成固体状态以提高这类制剂的稳定性。

(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂：用冷冻干燥法制备蛋白质类药物制剂时主要考虑两个问题，一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态下的长期稳定性;二是考虑辅料对冷冻干燥过程中一些参数的影响，如最高与最低干燥温度、干燥时间、冷冻干燥产品的外观等。

(2)喷雾干燥蛋白质药物制剂：喷雾干燥工艺广泛应用于蛋白质类药物的控释制剂、吸入剂、微球制剂等新型给药系统的研制中。在喷雾干燥过程中可加入稳定剂，如蔗糖能提高氧血红蛋白的稳定性。喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大(特别是小规模生产)，水分含量高。但只要精心控制工艺参数，选择适合稳定剂，可生产出粒径为3～5μm，水分含量为5%～6%的活性产品。

(二)蛋白质类药物新型给药系统

1.新型注射(植入)给药系统

腺苷酸脱氨酶(ADA)即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因ADA缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产。

(1)控释微球制剂：为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂。首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林聚丙交酯-乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30天之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。

常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法：

1)复乳液中干燥法

2)低温喷雾提取法

3)喷雾干燥法

4)超临界萃取法

2.非注射给药系统

研究非注射途径的给药系统，将有益于增加患者的顺应性。蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮和肺部给药。目前最有应用前景的属鼻腔给药，然而口服给药还是最受欢迎的给药途径，但难度很大。

(1)鼻腔给药系统：鼻腔给药是多肽和蛋白质类药物在非注射剂型中最有希望的给药途径之一。由于鼻腔黏膜中动静脉和毛细淋巴管分布十分丰富，鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛，鼻腔黏膜的穿透性较高而酶相对较少，对蛋白质类药物的分解作用比胃肠道黏膜低，因而有利于药物的吸收并直接进入体内血液循环。

(2)口服给药系统：蛋白质药物口服给药主要存在四个问题：①在胃内酸催化降解;②在胃肠道内的酶水解;③对胃肠道黏膜的透过性差;④在肝的首过效应。

1)微乳制剂

2)纳米囊

3)胰岛素肠溶软胶囊

4)胰岛素微球制剂

5)胰岛素脂质体

(3)直肠给药系统：由于直肠内水解酶活性比胃肠道低，而且pH接近中性，所以药物破坏较少，且药物吸收后基本上可避免肝的首过代谢，直接进入全身血液循环，同时也不像口服药物会受到胃排空及食物的影响，因此多肽类与蛋白质类药物直肠给药不失为一条理想的给药途径。

(4)口腔黏膜给药系统：口腔黏膜较鼻黏膜厚，但无角质层，由于面颊部血管丰富，药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入全身循环，可避免胃肠消化液及肝的首过作用。

(5)经皮给药系统：离子导入技术指电荷或中性分子在电场作用下迁移进入皮肤的过程。

(6)肺部给药系统：蛋白质类药物的肺部给药系统目前受到越来越多的关注。

(三)蛋白质类药物制剂的评价方法

1.制剂中药物的含量测定

2.制剂中药物的活性测定

3.制剂中药物的体外释药速率测定

4.制剂的稳定性研究

5.体内药动学研究

6.刺激性及生物相容性研究