第四章　血细胞化学染色的临床应用

　　一、过氧化酶染色

　　二、过碘酸-雪夫反应

　　三、碱性磷酸酶染色

　　四、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色

　　五、α-醋酸萘酚酯酶染色

　　六、醋酸AS-D萘酚酯酶染色和氟化钠抑制试验

　　七、碱性α-丁酸萘酚酯酶染色

　　八、酸性磷酸酶染色

　　九、铁染色

　　细胞化学染色是以细胞形态学为基础，运用化学、生物化学等技术对细胞内的各种化学物质(酶类、脂类、糖类、蛋白质、铁、核酸)进行染色观察，做定性、定位、半定量分析的方法。常规染色中使用较多的是酶类、糖类和铁染色。

　　1.过氧化酶(peroxidase，POX)染色

　　(1)原理：

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质内出现棕黑色颗粒。

　　①(-)无颗粒;

　　②(±)颗粒细小、弥散分布;

　　③(+)颗粒较粗、局灶分布;

　　④(++)颗粒粗大、密集、分布较广，占胞质的1/2～2/3;

　　⑤(+++)颗粒粗大、成团块，几乎布满胞质;

　　⑥(++++)颗粒成团块状，充满胞质，并覆盖胞核。

　　图A呈阳性反应的嗜酸性粒细胞，颗粒粗大(POX染色)

　　图B、C呈不同阳性反应强度的细胞(POX染色)

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)粒细胞系统：

　　2)单核细胞系统：原始单核细胞呈阴性反应，幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性反应，阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。

　　3)其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应。

　　主要关系粒、单、淋

　　(4)临床意义

　　1)帮助鉴别急性白血病的类型：

	急粒	急单	急淋
原始细胞反应	（＋）～（＋＋＋）	（－）～（＋）	（－）
阳性颗粒外观	一般较多，较粗大	少而细小，常弥散分布
备注	阴性不能排除本病

　　2)成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化

　　①活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染(特别是化脓菌感染)、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。

　　②活性减低：可见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、放射病及退化性中性粒细胞。

　　2.过碘酸-雪夫反应(糖原染色)

　　(periodicacid-Schiffreaction，PAS)

　　(1)原理：

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质内出现红色颗粒、块状或呈弥漫状红色。

　　①(-)胞质无色，无颗粒。

　　②(+)胞质淡红色或有少量红色颗粒，通常<10个颗粒。

　　③(++)胞质红色或有10个以上红色颗粒。

　　④(+++)胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。

　　⑤(++++)胞质呈紫红色或有粗大红色块状。

　　不用掌握具体分级

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)粒细胞系统：

　　原粒胞浆光镜下无颗粒。所以POX阴性。考察喜欢出这类题，哪个最强或最弱。嗜酸阳性反应的程度强。酸梅主要两点;粒系相关的酶;随着细胞成熟，阳性反应增强。

　　2)红细胞系统：幼红细胞和红细胞均呈阴性反应。

　　3)单核细胞系统：分化差的原始单核细胞呈阴性，其他单核细胞呈阳性。绝大多数阳性，呈细颗粒状。有时在胞质的边缘处阳性反应颗粒较粗大。

　　4)淋巴细胞：大多数淋巴细胞为阴性反应，少数淋巴细胞可呈(+)反应。

　　5)巨核细胞和血小板：巨核细胞为阳性反应，阳性反应物质为红色颗粒状，有时为红色块状。血小板为阳性反应，阳性反应物质为细颗粒状，有时为红色小块状。

　　6)其他细胞：浆细胞一般为阴性反应，少数可呈阳性反应，阳性反应物质为红色细颗粒状。巨噬细胞可呈阳性反应，阳性反应物质为红色细颗粒状。

　　正常骨髓象PAS染色呈不同反应的细胞

　　1-晚幼红细胞 2-嗜酸性粒细胞

　　3-中性分叶核粒细胞 4-单核细胞

　　(4)临床意义

　　1)红细胞系统：

　　红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中幼红细胞可呈阳性反应，有时阳性反应强且阳性率高，甚至红细胞也呈阳性反应。

　　急性红白血病时幼红细胞可呈阳性反应

　　某些红系良性疾病，如缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血)、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血中的幼红细胞常呈阴性反应，个别细胞可呈阳性但反应弱。

　　2)白细胞系统：急性淋巴细胞白血病时白血病性原始淋巴细胞的阳性反应物质为红色粗颗粒状或红色块状，底色不红;急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞的阳性反应物质呈均匀分布的红色细颗粒状或呈均匀红色;急性单核细胞白血病时，白血病性原始单核细胞的阳性反应物质呈红色细颗粒状，弥散分布，有时在胞浆的边缘处颗粒较粗大。

　　PAS在鉴别急性白血病类型中的应用

　　图A 急性淋巴细胞白血病时，白血病性淋巴细胞阳性反应物质为红色粗颗粒状或红色块状;

　　图B 急性单核细胞白血病时，白血病性单核细胞阳性反应物质呈红色细颗粒状，弥散分布。

　　3)其他细胞：①帮助鉴别不典型巨核细胞和霍奇金细胞或Reed-Sternberg细胞，前者呈强阳性反应，后者呈弱阳性或阴性反应。②帮助鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞，前者呈强阳性反应，后者呈弱阳性反应，且空泡中心为阴性反应。③帮助鉴别白血病细胞和腺癌骨髓转移的腺癌细胞，后者呈强阳性反应，阳性反应物质为红色细颗粒状或粗颗粒状，有时呈红色块状。

　　3.碱性磷酸酶染色

　　(neutrophilicalkalinephosphatase，NAP)

　　(1)原理(偶氮偶联法)：血细胞内的碱性磷酸酶在pH9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀：

　　①(-)无灰褐色沉淀，为0分。

　　②(+)胞质出现灰褐色沉淀，为1分。

　　③(++)胞质深褐色沉淀，为2分。

　　④(+++)胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。

　　⑤(++++)胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。

　　该染色结果计算比较特殊，算积分值。

　　NAP染色呈不同阳性反应的中性粒细胞

　　1-1分 2-1分 3-2分 4-3分 5-4分 6-4分

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)碱性磷酸酶主要存在于成熟中性粒细胞，除巨噬细胞可呈阳性反应外，其他血细胞均呈阴性反应。

　　2)成熟中性粒细胞碱性磷酸酶积分值的计算：在油镜下，计数100个成熟中性粒细胞(包括中性分叶核粒细胞和中性杆状核粒细胞)。分别记录其分级情况，全部阳性反应的细胞之和即为阳性率，将所有阳性反应细胞均以“+”级表示后，计算其总积分值。

　　例：某患者计数100个成熟中性粒细胞，其结果如下：

　　(4)参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)的积分值为30～130。由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。这里的正常值仅供参考。

　　(5)临床意义

　　1)生理变化：①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。

　　2)病理性变化：

　　①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高;在球菌性感染中，急性较慢性为高。病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染。

　　②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP积分值上升到正常。类白血病反应时的NAP积分值明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增强，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。因此本法常用来鉴别慢性粒细胞白血病(简称慢粒)和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一。

　　图A 慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低

　　图B 类白血病反应NAP活性增强

　　急性粒细胞白血病时NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病时NAP积分值一般增高，因此本法可作为鉴别急粒和急性淋巴细胞白血病(简称急淋)的方法之一;急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常;粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯细菌性感染增高的明显。

　　再生障碍性贫血的NAP积分值增高，当病情好转时，NAP积分值可下降，完全缓解时NAP活性可恢复到正常，因此本法对再生障碍性贫血(简称再障)的诊断、疗效观察和估计病情均有一定意义;阵发性睡眠性血红蛋白尿的NAP积分值减低，因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿和再生障碍性贫血的方法之一。

　　原发性红细胞增多症的NAP积分值升高，而继发性红细胞增多症的NAP积分值无明显变化，因此本法可用来鉴别真性红细胞增多症和继发性红细胞增多症;骨髓增生异常综合征的NAP积分值减低。

　　③其他：红白血病的NAP积分值减低，慢性淋巴细胞白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症和红血病等疾病的NAP积分值可增高;NAP积分值减低，也可见于镰形细胞性贫血、严重型嗜酸性粒细胞增多症、家族性低磷酸酶血症。

　　3)其他：应用肾上腺皮质激素、雌激素和ACTH后NAP积分值增高。

　　酯酶的分类

　　特异性酯酶：specific esterase，SE。

　　非特异性酯酶：nonspecific esterase，NSE。

　　4.氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色

　　(naphtholAS-Dchloroacetateesterase，NAS-DCE)

　　(1)原理：血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶将基质液中的氯乙酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，进而与基质液中的重氮盐GBC偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质内出现红色沉淀：

　　①(-)胞质无色。

　　②(+)胞质呈淡红色。

　　③(++)鲜红色沉淀布满胞质。

　　④(+++)深红色沉淀充满胞质。

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)粒细胞系统：原粒细胞为阴性反应或阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均为阳性反应，酶活性并不随细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，嗜碱性粒细胞为阳性反应。

　　2)其他血细胞：单核细胞为阴性反应，个别可呈弱阳性反应。淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞和血小板均呈阴性反应。

　　(4)临床意义：鉴别急性白血病的类型。

　　NAS-DCE在鉴别急性白血病类型中的应用

　　急性粒-单核细胞白血病中，粒系细胞为阳性反应(胞浆为红色)，其余细胞呈阴性反应。

　　5.α-醋酸萘酚酯酶染色

　　(α-naphtholacetateesterase，α-NAE)

　　(1)原理：血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)将基质液中的α-醋酸萘酚水解，产生α-萘酚，萘酚再与坚牢蓝B偶联，形成不溶性灰黑色或棕黑色沉淀，定位于胞质内。

　　(2)结果判断：染色阳性结果为胞质中出现棕黑色颗粒沉淀。

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)单核细胞系统原始单核细胞为阴性反应或弱阳性反应;幼单核细胞和单核细胞为阳性反应，这种反应可被氟化钠抑制。

　　2)粒细胞系统各期粒细胞为阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，此反应不被氟化钠抑制。

　　3)巨核细胞和血小板为阳性反应。

　　4)其他血细胞：幼红细胞和淋巴细胞一般为阴性反应，有时少数细胞也可是弱阳性反应，此反应不被氟化钠抑制;浆细胞为阴性反应。

　　(4)临床意义

　　1)鉴别急性白血病的类型。

　　α-NAE在鉴别急性白血病类型中的应用

　　图A 急性粒-单核细胞白血病α-NAE染色，单核细胞为阳性反应，其余细胞呈阴性或弱阳性反应。

　　图B 急性单核细胞白血病α-NAE染色，单核细胞呈强阳性反应。

　　6.醋酸AS-D萘酚酯酶染色和氟化钠抑制试验

　　(naphtholAS-Dacetateesterase，NAS-DAE)

　　(1)原理：血细胞内的醋酸AS-D萘酚酯酶与重氮盐偶联，形成不溶性蓝色沉淀，定位于胞质内。氟化钠抑制试验是以相同方法制备2份基质液，其中一份加入适量氯化钠，另一份不加氯化钠作对照。将已固定的2张相同标本的涂片混入这2种不同基质液中，分别作醋酸AS-D萘酚酯酶染色。

　　用油镜观察计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和阳性积分，按下述公式计算出抑制率。

　　(2)结果判断：染色阳性结果为胞质中出现棕黑色颗粒沉淀：

　　①(-)无颗粒沉淀，为0分。

　　②(±)颗粒少量、稀疏，为0.5分。

　　③(+)胞质内1/2区域出现颗粒沉淀，为1分。

　　④(++)胞质内3/4区域出现颗粒沉淀，为2分。

　　⑤(+++)胞质内布满颗粒沉淀，为3分。

　　⑥(++++)胞质内充满浓密的颗粒沉淀，为4分。

　　就醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE)而言，正常血细胞染色结果和临床意义基本同α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)。两者属于同一类细胞化学染色，临床通常选择其中一种。

　　7.碱性α-丁酸萘酚酯酶染色

　　(1)原理：血细胞内的α-丁酸萘酚酯酶(α-naphtholbutyrateesterase，α-NBE)在pH碱性的条件下水解基质液中的α-丁酸萘酚，释放出α-萘酚，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫绛GBC，形成的有色沉淀为红色。α-NBE主要存在于单核细胞中，其阳性产物能被氟化钠抑制，而其他细胞系列的阳性产物不能被氟化钠抑制。

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质中出现蓝色颗粒。

　　(3)正常血细胞的染色反应

　　1)粒细胞系统：各期粒细胞均呈阴性。

　　2)单核细胞系统：分化差的原单细胞呈阴性，分化好的原单细胞呈阳性，幼稚及成熟的单核细胞呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。

　　3)淋巴细胞系统：外周血的T淋巴细胞、非T非B淋巴细胞可呈阳性，B淋巴细胞呈阴性。

　　4)其他细胞：巨核细胞、幼红细胞、浆细胞呈阴性或弱阳性;组织细胞也可呈阳性，但不被氟化钠抑制。

　　(4)临床评价：与α-NAE染色的临床意义相同，敏感性不如α-NAE，而特异性较α-NAE高，是急性白血病常用的细胞化学染色。

　　人丁稀少，形单影只。

　　临床意义：辅助鉴别急性白血病细胞类型

　　α-NBE在鉴别急性白血病类型中的应用

　　8.酸性磷酸酶染色

　　(1)原理：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下，将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解，释放萘酚AS-BI，萘酚AS-BI与六偶氮付品红偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内，如果血细胞的胞质呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。

　　抗酒石酸酸性磷酸酶染色是用相同方法制备2份基质液，一份再加入适量L-酒石酸，另一份不加L-酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这2种不同基质液作酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸抑制的都呈阳性反应。如果不耐L-酒石酸抑制的，不加L-酒石酸的呈阳性反应，而加L-酒石酸的呈阴性反应。

　　(2)结果判断：阳性结果为胞质中出现鲜红色颗粒沉淀：

　　①(-)胞质无色。

　　②(+)胞质出现淡红色颗粒。

　　③(++)胞质布满鲜红色颗粒。

　　④(+++)胞质充满深红色颗粒。

　　(3)正常血细胞的染色反应：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞呈阳性。

　　(4)临床意义

　　1)帮助鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞，前者酸性磷酸酶染色为阳性反应，后者为阴性。

　　2)帮助诊断多毛细胞白血病，多毛细胞白血病时多毛细胞的酸性磷酸酶染色为阳性反应，此酶耐L-酒石酸的抑制作用。

　　3)帮助鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞，T淋巴细胞呈阳性反应，而B淋巴细胞为阴性反应。

　　急性T淋巴细胞白血病中T淋巴细胞几乎都为阳性

　　9.铁染色

　　(1)原理：细胞外含铁血黄素和幼红细胞内的铁与酸性亚铁氰化钾发生普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。

　　(2)正常血细胞的染色反应

　　1)细胞外铁：观察骨髓小粒中的铁，呈弥散蓝色、颗粒状、小珠状或块状。根据骨髓小粒中铁的存在方式及量将细胞外铁分为(-)、(+)、(++)、(+++)、(++++)。

　　2)细胞内铁：观察100个中幼红细胞和晚幼红细胞计算出铁粒幼红细胞的百分比。铁粒幼红细胞是指胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞，根据蓝色铁颗粒多少、粗细分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及环形铁粒幼红细胞。环形铁粒幼红细胞是指幼红细胞胞质内蓝色颗粒在5颗以上，围绕核周1/3以上者。成熟红细胞中出现铁颗粒称为铁粒红细胞。

　　图A 正常骨髓铁染色可见细胞外铁

　　图B 环形铁粒幼红细胞

　　(3)参考值

　　1)细胞外铁(+)～(++)，大多为(++)。

　　2)铁粒幼细胞12%～44%。

　　由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。

　　(4)临床意义

　　1)缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁明显减低，甚至消失;铁粒幼细胞的百分率减低。经有效铁剂治疗后，细胞外铁增多;因此铁染色可作为诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。

　　图A 缺铁性贫血骨髓铁染色未见细胞外铁。

　　图B 缺铁性贫血细胞内铁减少，铁粒幼细胞的百分率减低。

　　2)铁粒幼细胞贫血时，出现较多环形铁粒幼细胞，铁粒幼细胞也增多，其所含铁颗粒的数目也较多，颗粒也粗大，有时还可见铁粒红细胞。因此本染色可作为诊断铁粒幼细胞性贫血的重要方法。

　　3)骨髓增生异常综合征时铁粒幼细胞的百分比可增高，其所含铁颗粒的数目可增多，环形铁粒幼细胞常见。铁粒幼细胞难治性贫血，环形铁粒幼细胞在15%以上。

　　4)非缺铁性贫血如溶血性贫血、营养性巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血和白血病，细胞外铁正常或增高，铁粒幼细胞正常或增高。

　　5)感染、肝硬化、慢性肾炎及尿毒症、血色病及多次输血后，骨髓细胞外铁增加。

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