常用的工具酶和特异性试剂有：

　　胰蛋白酶：仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。

　　糜蛋白酶：仅作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。Trp、Tyr、Phe

　　CNBr：仅作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。

　　拼接：将2套多肽的aa顺序对照拼接，

　　<4>第四步：二硫键位置的确定：包括链内和链间二硫键的位置，用对角线电泳来测。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开。再用过甲酸、碘代乙酸、巯基乙醇处理，将二硫键打断。最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品(多肽或寡肽)，它们就是含二硫键的片段，上机测aa顺序，根据已测出的蛋白质的aa顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。

　　3.蛋白质一级结构测定的意义

　　<1>分子进化：将不同生物的同源蛋白质的一级结构进行比较，以人的为最高级，从而确定其它物种的进化程度，也可以制成进化树，由于这是由数据决定的，因此比形态上确定的进化更加科学和精确。

　　<2>证明了一个理论，即蛋白质的一级结构决定高级结构，最终决定蛋白质的功能。

　　<3>疾病的分子生物学：镰刀型贫血症的内因是血红蛋白的β6Val，正常的血红蛋白的β6Glu

　　4.1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。

　　弗雷德里克桑格，英国生物化学家，曾经在1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖：1955年确定了牛胰岛素结构而获得1958年度奖;设计出用P32放射性标记法结合双向电泳分离技术测定DNA分子中的核苷酸排列顺序的方法而分享1980年度奖。

　　1965年9月17日，中国首次人工合成胰岛素。这也是世界上第一个蛋白质的全合成。

　　(二)蛋白质的二级结构(secondary structure)

　　蛋白质的二级结构为主链构象，不涉及侧链构象。主链基本构象都是以酰胺平面(或称肽键平面、肽单元)为基本结构单位。蛋白质分子的空间结构有一些共同的规律可遵循，其中二级结构主要是周期性出现的有规则的α-螺旋、β-折叠、β-转角、和无规卷曲等几种二级结构单元，且这些有序的二级结构单元，主要是靠氢键等非共价键来维持其空间结构的相对稳定的。

　　1.二级结构概论

　　<1>二级结构的定义：肽链主干在空间的走向。主干指的是肽平面与α-C构成的链子。

　　<2>二级结构的内容：空间走向以及维持这种走向的力量：氢键和R基团的影响。

　　<3>二级结构的数学描述：ф角：肽平面绕N-Cα单键旋转的角度;ψ角：肽平面绕Cα-C羧基单键旋转的角度。

　　2.二级结构的常见类型

　　Pauling的贡献：莱纳斯鲍林是著名的量子化学家，他在化学的多个领域都有过重大贡献。曾两次荣获诺贝尔奖金(1954年化学奖， 1962年和平奖)，有很高的国际声誉。

　　X光衍射法是研究蛋白质构象的最好技术。

　　<1>α-螺旋(α-helix)：蛋白质中最常见,最典型,含量最丰富的二级结构单元.由1950年Pauling等人提出的.

　　其基本特征是：

　　⑴α-螺旋即像弹簧一样的螺旋，α-螺旋为右手螺旋。侧链伸向螺旋外侧。

　　⑵每一圈含有3.6个aa残基(或肽平面)，每一圈高(螺距)0.54nm，即每一个aa残基上升0.15nm，旋转了100o。

　　⑶维持α-右手螺旋的力量是链内氢键，它由第1个氨基酸肽键上CO，隔三个氨基酸残基，与第5个氨基酸肽键上NH形成氢键，其间包括13个原子，故又称3.613螺旋，且氢键方向与α-螺旋长轴基本平行。

　　影响a-螺旋形成的因素：破坏者Pro，该处折断，因为亚氨基不能形成氢键;不稳定者酸性aa、碱性aa，形成静电斥力，若一段肽链有多个碱性(酸性)氨基酸残基相邻, 防碍α螺旋的形成(Glu、Asp、Arg、Lys);太大R基团、太小R基团，产生空间位阻，，防碍α螺旋的形成(Gly、Ile、Asn、Leu)。

　　分布：毛发中的α-角蛋白，例如头发中的α-角蛋白。

　　<2>β-折叠：是肽链中比较伸展的空间结构，其中肽键平面接近平行、但略呈锯齿状或扇形。

　　维持β-折叠的力量：链间的氢键，它由2～5个肽段片层之间经CO与NH间形成的氢键系，但氢键方向与肽链长轴方向相垂直，且反平行方式排列在热力学上最为稳定。