第三节 蛋白质的结构

　　一.肽与肽键

　　<1>肽键(peptide bond)是蛋白质分子中的主要共价键，性质比较稳定。它虽是单键，但具有部分双键的性质，难以自由旋转而有一定的刚性，因此形成肽键平面(图2-3)，则包括连接肽键两端的CO、N-H和2个Cα共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上，而相邻2个氨基酸的侧链R又形成反式构型，从而形成肽键与肽链复杂的空间结构。

　　<2>肽(peptide)是氨基酸通过肽键相连的化合物，蛋白质不完全水解的产物也是肽。肽按其组成的氨基酸数目为2个、3个和4个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等，一般含10个以下氨基酸组成的称寡肽(oligopeptide)，由10个以上氨基酸组成的称多肽(polypeptide)，它们都简称为肽。肽链中的氨基酸已不是游离的氨基酸分子，因为其氨基和羧基在生成肽键中都被结合掉了，因此多肽和蛋白质分子中的氨基酸均称为氨基酸残基(amino acid residue)。

　　多肽有开链肽和环状肽。在人体内主要是开链肽。开链肽具有一个游离的氨基末端和一个游离的羧基末端，分别保留有游离的α-氨基和α-羧基，故又称为多肽链的N端(氨基端)和C端(羧基端)，书写时一般将N端写在分子的左边，并以此开始对多肽分子中的氨基酸残基依次编号，而将肽链的C端写在分子的右边。

　　写法和读法：规定书写方法为N端→C端，例如：Ala-Gly-Phe，读作：丙氨酰甘氨酰苯丙氨酸。

　　<3>肽的性质

　　1.酸碱性：肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是两性化合物，至少有2级解离，通常都有多级解离。因此，肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点PI，其计算与测定完全同氨基酸的。

　　例如：谷胱甘肽，Glu-Cys-Gly，，注意Glu-Cys之间的肽键(γ-，而不是正常的α-)，各解离基团的PK’值，PI=(2.13+2.34)/2=2.235，很酸。

　　2.双缩脲反应：双缩脲(相似于三肽，即2个肽键)、碱性铜离子、紫红色化合物。凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行。

　　<4>肽的实例

　　1.谷胱甘肽：注意Glu与Cys的连接(γ-，而不是正常的α-)，还原型GSH和氧化型GSSG，主要作用是还原剂，消除体内的自由基。

　　2.催产素和加压素：9肽或环8肽，都是脑垂体后叶激素，都有升血压、抗利尿、刺激子宫收缩、排乳的作用，催产素促进遗忘，加压素增强记忆。

　　二、蛋白质分子结构及其规律性

　　蛋白质是大分子化合物，一般由一条肽链、上百个氨基酸，即成千上万个原子组成，分为一、二、三、四4级、四个不同的层次，以便进行深入研究，其中二、三、四级均属于蛋白质的三维空间结构(three-dimensional structure，3D)或构象(conformation)。随着研究的深入，现在在蛋白质二级和三级结构之间，又增加了一些超二级结构和结构域(domain)。

　　(一)蛋白质的一级结构(primary structure)

　　蛋白质的一级结构，专指多肽链中氨基酸(残基)的排列的序列(sequence)。若蛋白质分子中含有二硫键，一级结构也包括生成二硫键的半胱氨酸残基位置。一级结构就是指蛋白质分子中由共价肽键相连的基本分子结构。不同的蛋白质，首先具有不同的一级结构，因此一级结构是区别不同蛋白质最基本、最重要的标志之一。

　　蛋白质一级结构的重要性，首先是由于其序列中不同氨基酸侧链R的大小、性质不同，决定着肽链折叠盘曲形成不同的空间结构和功能。

　　1.一级结构：即蛋白质的共价结构或平面结构，核心内容就是aa的排列顺序，它的改变涉及到蛋白质共价键的破坏和重建。

　　一级结构的全部内容包括：肽链的个数、aa的顺序、二硫键的位置、非aa成分。

　　2.蛋白质一级结构的测定

　　间接法：通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断aa的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。

　　直接法：用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出aa顺序。

　　<1>第一步：前期准备

　　分离纯化蛋白质：纯度要达到97%以上才能分析准确。

　　蛋白质分子量的测定：渗透压法、凝胶电泳法(聚丙烯酰胺、SDS)*、凝胶过滤法*、超离心法*等

　　aa组成的测定：氨基酸自动分析仪

　　肽链拆分：非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种，可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。共价键的仅二硫键1种，可用巯基乙醇、碘代乙酸、过甲酸来拆分。

　　<2>第二步：肽链的端点测定

　　N端测定：Sanger法，DNFB→DNP-肽→水解→乙醚萃取→层析鉴定

　　Edman法，PITC→PTC-肽→PTH-aa→层析鉴定

　　C端测定：肼解法，唯有C端aa与众不同，酰肼化合物与游离aa，再通过Sanger法来鉴定。Asn、Gln、Cys、Arg将被肼破坏，不能分析。

　　羧肽酶法：

　　羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基

　　羧肽酶B：仅Arg、Lys

　　羧肽酶C：所有的氨基酸残基

　　<3>每条肽链aa顺序的测定：aa顺序自动分析仪只能准确测定50aa以下的肽链，而一般的蛋白质都含有100以上的aa残基，所以，事先要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽，再上机分析，而且要2套以上，便于以后拼接。举例：

　　156987351256984523→15 698735 125 69845 23

　　→1569 873512569 84523