第一章　血液样本采集和血涂片制备

　　一、血液生理概要

　　1.血液组成

　　血液标本类型

　　①全血　适用于临床血液学检查。

　　②血浆　全血+抗凝剂+离心　适用于内分泌激素、血栓与止血检查。

　　③血清　全血+离心(静置)　适用于临床化学和免疫学检查。

　　不加抗凝剂，血清缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ(纤维蛋白原)、Ⅱ(凝血酶原)、Ⅴ、Ⅷ等。

　　血浆与血清的区别

　　2.血液理化性质

　　①血量：正常人血量约为(70±10)ml/kg体重，成人约4～5L，约占体重的6%～8%。

　　②颜色：严重CO中毒或氰化物中毒者血液呈樱红色。餐后，尤其是高脂膳食后，血浆呈乳白色。溶血患者血浆呈红色。

　　③酸碱度：pH 7.35～7.45

　　3.血液特性：悬浮稳定性、黏滞性(纤维蛋白原、球蛋白)、凝固性。

　　4.血液生理功能：具有运输功能、协调功能、维护机体内环境稳定和防御功能。

　　二、采血方法

　　(一)静脉采血法

　　1.概述

　　通常采用肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉。小儿可采颈外静脉血液。为避免血小板激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料试管。

　　2.操作方法和注意事项

　　(二)皮肤采血法(毛细血管采血法)

　　采血针

　　1.概述

　　部位→手指(WHO推荐左手无名指指端内侧)和耳垂。

　　2.操作方法

　　(1)准备：取合适试管，加适量稀释液。取微量吸管和乳胶吸头相连，检查连接处是否漏气，或取一次性微量吸管备用。

　　(2)按摩：轻轻按摩左手中指或无名指指端内侧，使局部组织自然充血。

　　(3)消毒：用75%乙醇棉签擦拭采血部位，待干。

　　(4)针刺：用左手拇指和食指固定采血部位使皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次性消毒采血针自指端腹内侧刺入，深度2～3mm，立即出针。

　　(5)拭血：待血液自然流出后，用无菌干棉球擦去第1滴血。

　　(6)吸血：用一次性微量吸管吸血，然后用无菌干棉球压住伤口止血。如血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端稍施压使血液流出。

　　(7)稀释：用无菌干棉球擦净微量吸管外部，将吸管伸入装有稀释液的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，并用上清液冲洗管内余血2～3次，最后将试管内的液体混匀。

　　3.注意事项

　　①所选择采血部位无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。

　　②本试验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性器材。

　　③皮肤消毒后，应待75%乙醇挥发后采血，否则流出的血液扩散而不成滴。

　　④因第1滴血混有组织液，应擦去。如血流不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。

　　⑤进行多项检查时，采血的顺序依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数等。

　　【口诀-SUN】

　　静脉肘部是首选，放血别忘拔针头，皮肤通常选手指，婴儿踇趾或足跟，多项检查小板先。

　　(三)真空采血法

　　真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。真空定量采血容器，根据需要标有不同的色码，适于不同检验项目。

　　常用彩色真空采血容器的用途

盖子颜色	添加抗凝剂	注意事项	用途
红色	无	凝块形成约30～60min	化学、血清学、血库
紫色	EDTA	须颠倒混匀6～8次	全血细胞计数（CBC）
淡蓝色	枸橼酸钠	须颠倒混匀；血液与抗凝比例为9:1	凝血检查（PT、APTT、因子测定）
绿色	肝素钠、肝素锂、肝素铵	根据实验需要，选择不同类型的肝素	化学
灰色	氟化钠	不能用于其他化学检查	葡萄糖、糖耐量
黄色	多茴香脑磺酸钠	须颠倒混匀8次	血培养
黑色	枸橼酸钠	血液与抗凝剂比例为4：1	血沉

　　质量控制

　　1.患者：患者活动情况、精神状态、药物、年龄、性别、种族、样本采集时间、吸烟、季节等都会影响检测结果。

　　2.采血：止血带结扎时间应小于1分钟，如超过2分钟，大静脉血流受阻而使毛细血管内压增高，使分子质量<5000的物质逸入组织液，或缺氧引起血液成分的变化，使检查结果增高或减低。

　　3.溶血：因容器不洁、接触水、强力振荡、操作不慎等可引起溶血，使红细胞计数、血细胞比容、血浆或血清化学成分(如钾、镁、转氨酶、胆红素)等多项指标检验结果发生变化。

　　4.样本处理：血液样本采集后应立即送检，并尽快进行检查，样本保存不当直接影响实验结果。血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。低温(4℃)保存血液可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项目确定最佳的保存条件。

　　5.实验结果分析：分析结果时，应考虑药物、饮食等因素对结果的影响。同时，应密切结合临床。

　　三、抗凝剂选择

　　1.乙二胺四乙酸(EDTA)盐

　　常用有钠盐或钾盐。

　　①抗凝原理：螯合钙离子。

　　②使用方法：量为1.5～2.2mg/ml血液。

　　③适用范围：对血细胞形态、血小板计数影响很小。

　　根据国际血液学标准化委员会(ICSH)建议，CBC抗凝剂用EDTA-K2。不适于凝血检查、血小板功能试验。

　　2.草酸盐

　　①抗凝原理：草酸钙沉淀。

　　②适用范围　双草酸盐

　　血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查。

　　不适于血小板计数、白细胞分类计数。

　　3.肝素

　　①抗凝原理：

　　加强抗凝血酶(AT)灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。

　　②使用方法：每毫升血液肝素用量为(15±2.5)U，多为肝素钠盐或钾盐。

　　③适用范围：红细胞渗透脆性试验。

　　不适于CBC、细胞形态学检查。

　　4.枸橼酸盐

　　①抗凝原理：能与血液中钙离子结合形成螯合物。

　　②使用方法：配成109mmol/L的浓度。

　　1:9------凝血

　　1:4------红细胞沉降率

　　③适用范围：凝血检查、红细胞沉降率、输血保养液。

　　四、血液涂片制备

　　一张良好的血片

　　①厚薄适宜

　　②头体尾明显

　　③细胞分布均匀

　　④血膜边缘整齐

　　⑤并留有一定空隙

　　血涂片的制备

　　①手工推片法　25°～30°夹角

　　血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容。

　　②厚血膜涂片法 疟原虫、微丝蚴等。

　　五、血液细胞染色

　　瑞氏染色法

　　1.染料组成

　　染料组成

　　酸性染料伊红(E-) 钠盐 阴离子

　　碱性染料亚甲蓝(M+) 氯盐 阳离子

　　将适量伊红、亚甲蓝溶解在甲醇中。

　　甲醇的作用：一是溶解亚甲蓝和伊红;二是固定细胞形态。

　　2.染色原理 　物理吸附与化学亲和作用

　　③中性颗粒　呈等电状态与E-和M+结合→淡紫红色

　　④红细胞

　　原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁，染成较浓厚的蓝色;中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色;完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。

　　3.pH值的影响

　　细胞各种成分均属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色;在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。

　　①pH< p>

　　②pH>pI→Pr带负电荷多→易与M+结合→染色偏蓝

　　磷酸盐缓冲液(pH6.4～6.8)

　　保证细胞受色时恒定最佳pH条件

　　4.注意事项

　　(1)血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。

　　(2)冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。

　　(3)染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。

　　六、方法学评价

　　1.血涂片制备

　　用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。

　　疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血膜涂片法。

　　2.血液细胞染色

　　瑞氏染色法：最经典、最常用。对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。

　　吉姆萨染色法：对细胞核、寄生虫(如疟原虫等)着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。

　　瑞-吉姆萨复合染色：使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。

　　瑞氏染料的质量规格用吸光度比值(rA)来评价。

　　新配制染料rA接近2，降到(1.3±0.1)染料即可使用。

　　新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待亚甲蓝逐渐变为天青B，贮存时间愈久，染色效果愈好。在贮存过程中，必须加塞，以防甲醇挥发和氧化成甲酸。所用甲醇须为AR级，若其中含过多丙酮，会使染色偏酸，白细胞着色不良。

　　七、质量控制

　　1.血涂片制备

　　血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。

　　血细胞比容增高、血液黏度较高时，采用小血滴、小角度、慢推;血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。

　　2.血液细胞染色

　　染色深浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切相关。