细菌革兰氏染色及形态识别

　　【准备】

　　1.个人准备 穿好工作服，戴好口罩、帽子。

　　2.物品准备 查看实验所需器材、试剂是否齐全，如不全，应及时向工作人员提出。

　　3.本实验所需器材试剂： 玻片、玻璃铅笔、接种环、酒精灯、火柴、计时器、吸水纸、显微镜、擦镜纸、生理盐水、蒸馏水、细菌培养物、结晶紫染液、卢戈碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红染液、乙醚。

　　【操作】

　　1.涂片：取玻片一张，用玻璃铅笔在玻片上划两个直径1.5cm左右的圆。用接种环在圆圈内各加1～2滴生理盐水。

　　2.接种环灭菌后，分别取细菌培养物少许，在生理盐水中磨匀。

　　3.干燥：将标本涂片标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

　　4.固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。

　　5.初染：将结晶紫染液加于制好的涂片上，染色1min。

　　6.用细流水冲洗，甩去积水。

　　7.媒染：加卢戈碘作用1min，用细流水冲洗，甩去积水。

　　8.脱色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，

　　9.然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止(约0.5min)，用细流水冲洗，甩去积水。

　　10.复染：加稀释石炭酸复红染0.5min

　　11.用细流水冲洗，甩去积水。

　　12.镜检：标本片用吸水纸吸干后，在涂片上滴加镜油，置显微镜下检查。

　　13.识别细菌的革兰氏染色结果(阳性或阴性)，报告结果。

　　14.断细菌形态特征(球菌、杆菌或螺旋菌)，报告结果。

　　【操作后】

　　1.用滴有乙醚的擦镜纸擦拭油镜镜头。

　　2.关闭显微镜电源。

　　3.将使用过的一次性器材，剩余标本置于污物桶中。

　　【注意事项】

　　1.载玻片要洁净无油迹，

　　2.滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚，以免脱色不全造成假阳性。

　　3.热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。

　　4.水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急，以免涂片菌膜脱落。

　　5.革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是关键环节，应严格掌握脱色时间，脱色不足，阴性菌误染成阳性菌;脱色过度，阳性菌误染成阴性菌。