第二节 抗原抗体反应的类型

　　按照反应的性质，可将血清学反应分为;凝聚性反应如凝集反应和沉淀反应等，有补体参与的反应如溶菌反应、溶血反应、补体结合反应、单扩散溶血反应、团集反应、免疫粘连红细胞凝集反应;与活体有关的中和试验如毒素一抗毒素中和反应、病毒一抗病毒血清中和反应;标记抗体技术如荧光抗体、酶标记抗体、同位素标记抗体、铁蛋白标记抗体等。上述血清反应，在近十余年来，凝聚性反应和标记抗体技术发展很快，其应用范围越来越广，已成为微生物学和免疫学领域研究的重要工具。

　　一、凝集反应

　　细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在电解质参与下，经过一定时间，抗原颗粒互相凝集成肉眼可见的小团块，称为凝集反应。参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素;就抗体的性质来说，主要是IgG和IgM。近些年来，为提高反应的敏感性，已由经典的直接凝集反应发展为有载体参与的间接凝集反应，它可用于可溶性抗原一抗体系统的检测。

　　1.直接凝集反应 颗粒性抗原与凝集素直接结合，并呈现肉眼可见的凝集现象。按其操作方法有试管法、玻板法及玻片法三种，前两种系定量试验，通过检测血清中的抗体滴度，达到诊检布氏菌病等传染病的目的;后一种系定性试验，用标推诊断血清鉴定未知细菌。

　　2. 间接凝集反应 将可溶性抗原(抗体)先吸附于一种与免疫无关的、、一定大小的惰性颗粒状物体(裁体颗粒)表面上，制成所谓的固相抗原(抗体)，然后与相应抗体(抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，载体即可发生明显地凝集，从而可显著地提高检测的敏感性，反应中的颗粒性载体起着“放大器”的作用。通常将这类血清反应称为间接(或被动)凝集反应。常用的载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉等。所以间接凝集反应根据所用载体的不同，又可分为间接红细胞凝集反应、间接乳胶凝集反应和间接炭凝集反应等。如果先将可溶性抗原与被抗体混合，间隔一定时间后，再加入抗原致敏的红细胞，因标本中的抗体已被先加入的抗原结合，抗原致敏的红细胞则不能再与被检标本中的抗体发生凝集现象，此称为间接红细胞凝集抑制试验。

　　间接凝集反应具有特异、敏感、快速、简便、使用方便等优点，故在抗原、抗体及激素、酶等的检测中，已广泛应用。

　　3.协同凝集反应 99%以上的金黄色葡萄球菌的细胞壁上均含有A蛋白，其含量因菌株不同而相差悬殊。Forsgren和Sioquist于1966年提出，SPA可与人和大多数哺乳动物血清(两栖类、爬虫类、鱼类除外)中IgG的Fc片段发生非特异性结合，因为它不是抗原—抗体的结合，故将此种结合称为“假免疫反应”。Ig分子的Fc片段与金黄色葡萄球菌上的A蛋白结合后，Fab片段则暴露于外，并保持原来正常抗体的活性，当与特异性抗原相通时，便可发生结合，形成肉眼可见的小凝集块，此即所谓的协同凝集反应。该反应除保持标记抗体原来的特异性外，还具有更高的敏感性，不但可使颖粒性抗原，而且也能与可溶性抗原在2分钟内出现清晰的凝集现象。这种凝集反应属于反向间接凝集的范畴，不仅可以省去红细胞鞣酸化的麻烦，而且可以免去抗体纯化的手续，因SPA只能与IgG结合，所以它对免疫血清起着天然的纯化作用。

　　此外，也可从培养物中将SPA提出，以其替代第二抗体，进行ELISA或IFA等试验。

　　目前国内已用此反应对流乙脑炎病毒、流感病毒、炭疽杆菌、链球菌、红斑丹毒丝菌、猪巴氏菌、沙门氏菌及钩端螺旋体的鉴定及分型。

　　4. 抗球蛋白凝集反应 作为抗体的免疫球蛋白分子对抗原来说，具有高度的特异性，同时它又具有良好的抗原性。应当注意的是，抗体球蛋白的抗原决定基只与该抗血清的动物来源有关，而与抗体的特异性无关，如用猪制备的IgG，不管是抗猪丹毒血清的IgG，还是正常猪血清的IgG，它们的抗原性完全相同，所以用正常猪血清免疫兔或羊所获得的兔抗猪或羊抗猪的IgG血清，即抗球蛋白血清，亦即抗体，它对只要是猪的或羊的IgG都有反应，不管是抗猪瘟IgG，抗猪丹毒IgG，抗羊布病IgG，还是正常猪或羊血清的IgG。

　　抗球蛋白血清消除在后述的间接荧光抗体染色法、酶联免疫收附试验间接法等技术中广泛应用外，还可直接用于下述的抗球蛋白试验。

　　机体受抗原刺激后，除产生完全抗体外，在免疫后期也可产生不完全抗体，它属于IgG、IgA或IgM。因为不完全抗体的体积小，长度短(250A)，只能与一个抗原的决定基结合，而不能同时再与另外一个抗原的决定基结合，因此不出现肉眼可见的凝集反应。Coombs等首先根据“抗体存在于球蛋白，球蛋白本身注入异种动物也是抗原”的原理，把产生不完全抗体的正常动物血清球蛋白，注射到异种动物体内，使之产生抗球蛋白抗体，将抗球蛋白抗体加到抗原与不完全抗体的复合物中，使它构成桥梁形式，从而出现直接可见的凝集反应，故这种反应也称为桥梁凝集反应。又因为这种反应是由Coombs等首先建立的，故也称为Coombs抗球蛋白凝集试验。

　　在检验工作中，可用该试验检查动物血清中抗某些微生物的不完全抗体，如布氏菌病及Q热等。

　　二、沉淀反应

　　细菌外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原，可以是多糖、蛋白质或类脂等，由于抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，故在作定量试验时，为了不使其过剩，通常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。参与沉淀反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。

　　沉淀反应可分为在液体中进行的液相沉淀反应(包括环状沉淀反应与絮状沉淀反应)和在琼脂凝胶中进行的固相琼脂扩散沉淀反应;琼脂扩散沉淀反应与电泳技术结合，又发展为免疫电泳、对流电泳和火箭电泳技术等，这些方法已在免疫化学研究中广泛地被应用。

　　1.环状沉淀反应 往最小试管内先加入已知的诊断血清，然后小心地加入待检抗原于血清表面，成为分界清晰的两层，1分钟至数分钟后，于两层液面交界处出现白色沉淀环为阳性反应，否则为阴性反应。

　　在兽医临床上常用本反应协助诊断炭疽病。这个试验最先是由意大利学者Ascoli氏在1902年建立的，所以，也叫Ascoli氏反应。该反应的特异性较差。

　　在法医学上，常用本反应鉴别沾在衣服、纸张、墙壁、刀子等上面的微量血迹。为了证实它是人血、鸡血、狗血或羊血等，常采用环状沉淀反应作测定。试验时，将高效价的抗人、抗鸡、抗狗或抗羊等免疫血清分别加往反应管中，再用生理盐水洗下上述待检血迹溶液作为抗原，分别重叠于加有上述免疫血清的上面，如果和抗鸡免疫血清出现白色沉淀环，其他各管和对照管均阴性，则证明该血迹为鸡血。其他也如此。

　　此外，还可用此试验鉴别肉类的真伪，检查媒介昆虫的吸血习性等。

　　2.絮状沉淀反应 将抗原与相应抗体在试管内或凹玻片上泥匀，经过一定时间，如出现肉服可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物，为阳性反应，如诊断梅毒的康氏反应及用标准类毒素测定抗毒素血清效价的絮状试验等。

　　3.琼脂扩散沉淀反应 所用琼脂凝胶含水量达99%左右，能允许分子星在20万以下物质自由通过，而多数抗原和抗体的分子量均在20万以下，故能在琼脂凝胶中自由扩散，当二者在琼脂凝胶中相遇，便在最适比例处产生沉淀物，因为沉淀物的分子较大，不能往外扩散;故形成肉眼明显可见的沉淀带，称为琼脂扩散沉淀反应。

　　琼脂扩散沉淀反应根极其扩散的方向，有单向扩散和双向扩散;根据抗原抗体二者是一方扩散，还是双方扩散，又有单扩散和双扩散之别。因此在实践中，琼脂扩散沉淀反应就有单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散和双向双扩散4种类型。其中以双向单扩散和双向双扩朗应用范围较广，前者用于抗原定量或诊断鸡马立克氏病等，后者检测马传贫及分析抗原成分等。

　　4.免疫电泳 是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组分的一种定性方法。试验时，先将待检抗原样品放在琼脂板的小孔中进行电泳，然后再于琼脂板上挖一横槽，加入已知相应的免疫血清，两者经一定时间的相互扩散后，在最适比例处形成沉淀弧，根据弧的数量、位置、外形等，即可分析样品中所含的成分及其性质。

　　5.对流免疫电泳 将免疫血清置于靠近琼脂板正极的孔内，待检抗原置于靠近负极的孔内。通电后，由于待检的可溶性蛋白质抗原在碱性环境中(pH值8.6的巴比妥缓冲液中)带负电，则向正极呈直线移动;抗体为球蛋白，分子较大，移动较慢，同时受琼脂电渗的影响，则向负极移动，当二者在比例最适宜处相遇时，便形成白色沉淀线。可用本试验检测鼻疽、水貂阿留申病，或检查血清中的胎甲球蛋白，以诊断肝癌。

　　三、有补体参加的反应

　　补体是机体非特异性免疫的重要体液因素，分散存于体液内，在被激活以前，并不表现免疫活性，当与抗原和抗体的复合物结合时，便被活化，从而导致一系列的免疫反应。有补体参与的血清反应，可大致分为两类：一类是补体被激活后，直接引起的反应，如溶血反应、溶菌反应、免疫粘连红细胞凝集反应等，其中的溶血反应常作为补体结合反应中是否有游离补体存在的指示系统。另一类是补体与抗原抗体复合物结合后，不引起可见反应，但可用指示系统测定补体是否已被结合，从而间接地检测反应系统中是否存在抗原抗体复合物，如补体结合反应等。

　　(一)溶解反应 带有抗原的靶细胞与相应抗体结合后，如为无核细胞一红细胞则被溶解，如为有核细胞一肿瘤细胞，则被杀死，细菌则介于二者之间，少数被溶解，但多数则被杀伤而失去活力。它又包括以下两种反应，即溶血反应与溶菌反应。如红细胞与相应抗体结后合，在有电解质存在时，红细胞可被凝集，但当红细胞与特异性抗体(溶血素)结合后，在有补体存在时，则红细胞被溶解，此现象称为溶血反应，此反应通常用来作为补体结合反应中的指示系统。但当输血发生错误，血型不符时，在受者体内也能发生溶血反应。

　　若抗原为某些细菌，当与相应抗体结合后，在有补体存也的情形下，有时可发生溶菌反应。它是构成特异性免疫的保护性反应。

　　(二)补体结合反应 以是否溶血为标志，间接测定补体是否被待检的抗原一抗体复合物所消耗的一种反应，称为补体结合反应。如果不溶血称为补体结合反应阳性;发生溶血，则称为补体结合反应阴性。

　　1.原理和基本方法 本反应包括两个系统，一为被检系统(溶菌系统)，包括已知的抗原(或抗体)、被检的抗体(或抗原)和补体;另一为指示系统(溶血系统)，包括绵羊红细胞和溶血素。操作时，先将被检系统的抗原、抗体及补体滴加于试管中，作用一定时间，然后加入指示系统，继续作用一定时间后，观察结果。如果不发生溶血，即为补体结合反应阳性，表示被检系统的抗原与抗体相对应，二者特异性结合后，消耗完了补体，故不溶血。反之，若出现溶血，则为补体结合反应阴性，表示被检系统中的抗原与抗体不相对应，或者二者缺少一个，补体未被消耗，故当加入绵羊红细胞和溶血素后，补体便被指示系统中的抗原抗体复合物结合，从而发生溶血反应如图示。

　　2.应用 由于补体结合反应具有高度的特异性和敏感性，虽然操作繁杂，目前在医疗实践中，应用仍然很广。

　　(1)用己知抗原诊断传染病 在兽医临床上常用于鼻疽、牛肺疫、布氏菌病、钩端螺旋体病、流行性乙型脑炎及锥虫病等的诊断。

　　(2)用已知抗体鉴定未知抗原 如流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的分型等可按此原则进行。

　　(三)固相补体结合反应 系根据直接补体结合反应的原理设计而成，只不过用琼脂糖凝胶代替生理盐水作介质实施反应，即将鼻疽抗原、被检血清与补体等量混合，放温箱中感作1小时后，取混合物满加于顶先制备好的含溶血素致敏绵羊红细胞的琼脂糖凝胶盘的相应孔中，与此同时，每份血清并须作一个不加抗原的对照孔，再置恒温箱中感作3小时，然后根据每份血清对照孔与试验孔之间发生的溶血环直径差的大小确定结果，凡在0.5mm以上者，判为鼻疽阳性。

　　(四)单扩散溶血反应 又称固相溶血试验，根据抗原与相应抗体相遇形成免疫复合物，通过传统途径激活补体，可以使绵羊红细胞发生溶血，其溶血程序与特异抗体滴度成正比的原理设计而成。即取用鼻疽抗原致敏的绵羊红细胞加入融化的琼脂糖凝胶中，混合均匀，浇注制成致敏的反应盘，打孔，随后将被检血清和补体等量混合后，加入到含抗原致敏的红细胞琼脂糖凝胶反应盘的孔中，于室温下感作3～4小时，阳性者，在孔的周围发生明显的溶血环，其直径在8.1mm以上。

　　(五)团集反应

　　此试验的原理与直接补体结合反应基本相同，只是以加热灭活的正常牛血清(称为团集素)替代补反中的溶血素，以新鲜马血清代替海猪血清为补体进行。试验时，将试验系统和指示系统先后加于试管中感作一定时间后，如果被检血清中没有与书籍抗原相应的抗体存在，绵羊红细胞则在新鲜马血清(补体)存在的条件下，可被团集素团集呈红色片状物，沉于反应管底部，为阴性反应。如果试验系统中有与已知抗原相应的抗体存在，则将新鲜马血清中的补体消耗掉，指示系统中的红细胞则不被团集，此为阳性反应。

　　团集反应可用于鼻疽和牛肺疫等传染病的诊断。

　　(六)免疫粘连红细胞凝集反应 抗原—抗体复合物与补体的前四种成分C1、C4、C2、C3依次结合后，可形成抗原抗体—C1(—)4(—)2(—)3(—)复合物，被活化的C3(—)能与具有免疫粘连受体的指示细胞(如动物白细胞、血小板及灵长类的红细胞，也可用人的O型红细胞)发生粘连作用，这个试验系统极敏感，只要有少量的抗原—抗体复合物存在，就可通过补体系统的作用，使指示细胞发生肉眼可见的凝集。

　　本试验，多作已知抗体检测分子量在几十万以上的巨分子蛋白质抗原，尤其是对病毒、类病毒最敏感，其敏感性比琼扩大1万倍，比对流电泳大500倍，比补反大40倍，检测的抗原如系颗粒性的，红细胞可粘附在它的周围，于显微镜下观察呈花瓣状。

　　四、免疫标记技术

　　免疫标记技术是指用荧光素、酶、放射性同位素、SPA、生物素—亲和素、胶体金等作为示踪物，对抗体或抗原标记后进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测定仪、酶标检测仪等精密仪器，对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。该法可以在细胞、亚细胞或分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究;或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般血清学方法。

　　根据试验中所用标记物和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫技术、SPA免疫检测技术、生物素—亲和素免疫检测技术、胶体金免疫检测技术等。

　　(一)免疫荧光技术：

　　1. 原理 将具有荧光特性的荧光材料联结到提纯的抗体分子上，制成荧光抗体，荧光抗体同样保持特异性结合抗原的能力。当抗原与荧光抗体结合，在荧光显微镜下观察，即可对待检的抗原进行定性和定位测定。常用的荧光材料是异硫氰酸荧光素。

　　2. 荧光抗体染色方法

　　(1)直接法：常用于检测病变组织中细菌、病毒抗原。即将荧光素直接标记在待检抗原的抗体上。此法的优点是简单、特异，缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗原，且敏感性低于间接法。

　　(2)间接法：用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)。试验分两步，首先将阳性抗体(第一抗体)加在待测抗原标本上，作用一定时间后，洗去未结合的抗体;然后滴加标记抗抗体，如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异性荧光。此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物对多种不同抗原的抗体系统。但缺点是间接法有时会产生非特异性荧光。

　　(二)免疫酶技术：

　　免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合。

　　该法的原理是将特定的酶联结于抗体分子上，制成酶标抗体，抗原抗体特异性结合，并通过酶对底物的高效催化作用而显色，从而对抗原(或抗体)进行定性、定位、定量测定。常用酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常见的免疫酶技术有以下几种：

　　1. 免疫酶组化染色技术 免疫酶组化染色技术与荧光抗体染色法基本相同，但每加一层，均需于37℃作用30min，然后以PBS反复洗涤3次，以除去未结合物。该法主要用于抗原的定性、定位测定。

　　(1)直接法：与荧光抗体的直接法相似。病理组织经冰冻切片或石蜡切片后，加酶标抗体染色标本，PBS冲洗，然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。本法优点是不需特殊的荧光显微镜设备，且标本可长期保存。

　　(2)间接法：同荧光抗体的间接法。标本用相应的阳性抗体染色后，PBS冲洗，再加入酶标记的抗球蛋白抗体，然后经显色显示抗原—抗体—抗抗体的存在。

　　(3)抗抗体搭桥法：本法不需事先制备标记抗体，是利用抗抗体既能与反应系统的抗体结合，又能与抗酶抗体结合(这两种抗体必须是同源的)的特性，以抗抗体做桥连接抗体和抗酶抗体。先加抗体(如兔抗血清)使之与标本上的抗原发生特异性结合，然后加抗抗体(羊抗兔血清)与抗体结合，再加既能与抗抗体结合又能与酶结合的兔抗酶抗体，随后加入酶，最后用底物显色。此法的优点是克服了因与抗体交联引起的抗体失活和标记抗体与非标记抗体对抗原的竞争，从而提高了敏感性;但抗酶抗体与酶之间的结合多为低亲和性，冲洗标本时易被洗脱，使敏感性降低。

　　(4)杂交抗体法：将特异性抗体分子与抗酶抗体分子经胰酶消化，使成双价F(ab)2片段，将这两种抗体的F(ab)2片按适当的比例混合，在低浓度的乙酰乙胺和充氮条件下，使之进一步裂解为单价Fab片，再在含氧条件下使其还原复合。经分子筛层析后，即可获得25%～50%的杂交抗体。这种杂交抗体分子含有两个抗原决定簇，一边能与特异性抗原结合，另一边能与酶结合。因此，不需事先准备标记抗体。试验时含抗原的标本直接用杂交抗体和酶处理，即可浸入底物溶液中，进行染色反应。本法步骤少，操作简便，但杂交抗体不易制备。

　　2. 酶联免疫吸附试验 是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或酶联免疫测定仪判定结果的一种方法。因本法特异性高，敏感性强，不需特殊设备，一次可检测大批标品，48h出结果等优点，是当前发展最快、最容易，试剂盒也应用最广的一项新技术。

　　(三)放射免疫技术

　　(四)SPA免疫检测技术

　　(五)生物素—亲和素免疫检测技术

　　(六)胶体金免疫检测技术

　　例题：

　　1.T细胞分化成熟的场所是

　　A.骨髓

　　B.胸腺

　　C.腔上囊

　　D.淋巴结

　　E.脾

　　2.人类T细胞不具备的受体是

　　A.E受体

　　B.IgG Fc受体

　　C.C3b受体

　　D.DHA受体

　　E.IL—2受体

　　3.关于IgA下述哪项是正确的

　　A.二聚体IgA结合抗原的亲合力，高于单体IgA

　　B.IgA1主要存在于血清中

　　C.sIgA是膜局部免疫的最重要因素

　　D.sIgA具有免疫排除功能

　　E.以上均正确

　　参考答案

　　1.B 2.C 3.E