四、 终止子和终止因子

　　终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。

　　终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。

　　有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。

　　终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。

　　1、 大肠杆菌中的两类终止子

　　所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。

　　(1)、 不依赖于ρ的终止子(简单终止子)

　　简单终止子除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文对称区通常有一段富含GC的序列。寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。

　　(2)、 依赖ρ的终止子

　　依赖ρ的终止子，必需在ρ因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。ρ因子是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。

　　2、 抗终止作用

　　通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。

　　抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开，通过抗终止作用可以打开后基因的表达。

　　λ噬菌体前早期(immediate early)基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读，从而表达晚早期(delayed early)基因。晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它能使晚早期基因得以表达。

　　RNA转录后的加工

　　RNA聚合酶合成的原初转录产物，要经过剪切、修饰、拼接等过程，才能转变成成熟的RNA分子，此过程称RNA转录后的加工。

　　(1)、 原核、真核的tRNA、rRNA(稳定的RNA)

　　细胞内的tRNA、rRNA相对稳定，半衰期一般为几个小时。所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物，都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。

　　a. 原初转录产物的5’是三磷酸(pppG、pppA)，而成熟的tRNA、rRNA ，5’是单磷酸。

　　b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。

　　c. 所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基(A、G、C、U以外的碱基)。

　　(2)、 真核的mRNA

　　单顺反子，多内含子。寿命比原核mRNA的长。

　　内含子、内元(intron)：在原初转录物中，通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列，或基因中与这种序列对应的DNA序列。

　　外显子、外元(exon)：原初转录物通过RNA拼接反应后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中与成熟RNA对应的DNA序列。

　　(3)、 原核mRNA

　　多顺反子，半衰期只有几分钟。这是原核生物重要的调控机制，如果一种酶或蛋白质不再需要时，只需简单地关闭其mRNA的合成就行了。

　　一、 原核生物RNA的加工

　　在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间(增加有效信息)。其它的tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子，它们在形式多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。

　　1、 原核rRNA前体的加工(E.coli)

　　E.coli共有三种rRNA

　　5S rRNA 120b

　　16S rRNA 1541b

　　23S rRNA 2904b

　　rRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30S。

　　大肠杆菌有7个rRNA的转录单位(操纵子)，它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。

　　RNAaseⅢ是一种rRNA、多顺反子mRNA加工的内切酶，识别特定的RNA双螺旋区。

　　RNAase E也可识别P5(5SrRNA前体)两端形成的双螺旋区。

　　2、 原核tRNA前体的加工

　　E.coli染色体基因组有60个tRNA基因，即某种a.a.的tRNA基因不止一个拷贝。

　　tRNA基因大多成簇存在，或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。

　　tRNA前体加工步骤

　　a. 核酸内切酶(RNAaseP、RNAaseF)在tRNA两端切断。

　　b. 核酸外切酶(RNAaseD)从3’端逐个切去附加序列。

　　c. 在tRNA3’端加上-CCA-OH。tRNA核苷酰转移酶

　　d. 核苷的修饰(修饰酶)：甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸(SAM)，假尿苷合成酶。

　　(1)、 RNAase P

　　能识别空间结构，很干净地切除tRNA前体的5’端。

　　含有蛋白质和RNA(M1 RNA)两部分。M1 RNA含375nt，在某些条件下，(提高[Mg2+]、或加入胺类)，RNAase P的RNA能单独地切断tRNA前体的5’端序列。

　　(2)、 RNAaseF

　　不干净地切除tRNA前体的3’端序列，需要RNAase D进一步修剪。

　　3、 原核mRNA前体的加工

　　由单顺反子构成mRNA，一般不需加工，一经转录，即可直接进行翻译。有些多顺反子构成的mRNA，须由核酸内切酶切成较小的mRNA，然后再进行翻译。

　　例：核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶β、β’亚基的基因组成混合操纵子。

　　它在转录出多顺反子mRNA后，由RNAaseⅢ将核糖体蛋白质基因与聚合酶亚基基因的mRNA切开，然后各自翻译。

　　该加工过程的意义：可对mRNA的翻译进行调节，核糖体蛋白质的合成必须适应于rRNA的合成水平，而细胞内RNA聚合酶的合成水平则要低得多。两者切开，有利于各自的翻译调控。

　　二、 真核生物RNA的加工

　　真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似，但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。

　　1、 真核rRNA前体的加工

　　真核生物核糖体的小亚基含：16-18S rRNA，大亚基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA(特有)。

　　真核rRNA基因拷贝数较多，几十至几千个之间。

　　真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。5SrRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工。

　　哺乳动物：45SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA

　　果蝇：38SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA

　　酵母：37SrRNA 前体，17S、5.8S、26S rRNA

　　rRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核糖2’-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。

　　真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。

　　2、 真核tRNA前体的加工

　　真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。

　　真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录。

　　真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。

　　3、 真核生物mRNA前体的加工

　　mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA(hn RNA)。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。

　　hnRNA半寿期很短，比细胞质中的mRNA更不稳定，一般在几分钟至1小时。而细胞质mRNA的半寿期为1-10小时，神经细胞mRNA最长可达数年。

　　hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括：

　　a. 5’末端形成帽子结构

　　b. 3’末端切断并加上polyA

　　c. 剪接除去内含子对应的序列

　　d. 甲基化

　　(1)、 5’末端加帽

　　RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA(鸟嘌呤-7)甲基转移酶，mRNA(核苷-2’)甲基转移酶。

　　由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。

　　★5’帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。

　　★5’帽子的功能

　　a. 在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。

　　b. 保护mRNA，避免5’端受核酸外切酶的降解。

　　(2)、 3’端加polyA

　　hnRNA链由RNAaseⅢ切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。

　　加尾信号：AATAAA、YGTGTGYY(Y为嘧啶)。

　　高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有一段非常保守的序列AAUAAA，这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。

　　核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly(A)比mRNA略长，平均150-200nt。

　　polyA的功能

　　a. 防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。

　　b. 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。

　　3’脱氧腺苷(既冬虫夏草素)是多聚腺苷酸化的特异抑制剂，但它不抑制hnRNA的转录。

　　(3)、 mRNA甲基化

　　某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤(m6A)。

　　三、 RNA的拼接和催化作用(内含子的切除)

　　多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区(外显子)成为连续序列。

　　有些内含子可以催化自身的拼接(self-splicing),有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。

　　1、 tRNA前体的拼接

　　酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1/10，内含子长度14-46bp，没有保守性。

　　切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是什么保守序列。

　　拼接过程：

　　第一步切除内含子，第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接。

　　P375图20-9酵母tRNAPhe及其前体的结构

　　P376图20-10酵母和植物tRNA前体的拼接过程

　　2、 四膜虫rRNA前体的自我拼接

　　四膜虫35S rRNA前体，经加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。

　　某些品系的四膜虫在其26SrRNA基因中有一个内含子，35S rRNA前体需要拼接除去内含子。该拼接过程只需一价和二价阳离子和鸟苷酸(提供3’-OH)，无需能量和酶。

　　3、 mRNA前体的拼接

　　真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。此规律称GT-AG规律(对于mRNA就是GU-AG，此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因)

　　酵母核基因的内含子在靠近3’端还有一个保守序列，与5’端序列互补，称为TACTAAC box，也与拼接有关。

　　真核细胞内存在许多种类的小分子RNA，大小在100-300nt，有些由聚合酶III转录，有些由聚合酶II转录。

　　核内小RNA(snRNA)主要存在于核内，细胞质小RNA(scRNA)主要存在于细胞质。

　　重要的snRNA有U系列snRNA，因其尿嘧啶含量高而得名。U系列snRNA通常都与多肽或蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒(RNP)。U-snRNA参与hnRNA的拼接过程。U3-snRNA与rRNA前体的加工有关，U1、U2、U4、U5、U6可能都与hnRNA的加工有关。

　　真核生物编码蛋白质的核基因的内含子属于II类内含子(反式剪接)

　　四、 RNA的催化功能

　　1、 I类内含子的自我剪接(顺式剪接)

　　I类内含子包括四膜虫rRNA的内含子(1981，Cech,美国)，几种酵母线粒体的内含子，噬菌体T4胸苷酸合成酶的内含子(1984，Apirion,美国)等。这些内含子有较大的同源性，可自我拼接。

　　2、 独具催化活性的小分子RNA

　　1984，Altman，Pace(美国)，细菌加工tRNA前体的酶—RNAase P中的M1RNA在高浓度的Mg2+或胺类存在时能单独切下tRNA前体的5’端。

　　RNA的复制

　　有些RNA病毒，进入寄主细胞后，借助复制酶而进行RNA病毒的复制。从感染RNA病毒的细胞中可以分离出RNA复制酶，这些RNA复制酶的模板特异性很强，只识别病毒自身的RNA，它以病毒RNA为模板，合成与模板性质相同的RNA。

　　一、 噬菌体QβRNA的复制

　　噬菌体Qβ：直径20nm，正十二面体，含30%RNA，其余为蛋白质，单链RNA，4500个核苷酸，编码3-4个蛋白质。

　　结构：5’端——成熟蛋白(A或A2蛋白)——外壳蛋白(或A1蛋白)——复制酶β亚基——3’端

　　Qβ复制酶：αβγδ四个亚基，只有β是自己编码，其余三个亚基来自寄主细胞。

　　进入E.coli细胞后，其RNA即为mRNA，可以直接合成与病毒繁殖有关的蛋白质(复制酶β亚基)。

　　QβRNA的复制过程：在Qβ特异的复制酶合成并装备好后就开始病毒RNA的复制。

　　QβRNA翻译和复制的自我调节：

　　QβRNA的高级结构(尤其是双螺旋区的结构)参与翻译的调节控制：

　　(1) 只有刚复制的QβRNA，成熟蛋白基因才能翻译。

　　(2) 核糖体能直接启动外壳蛋白基因的翻译

　　(3) 复制酶β亚基基因只有在外壳蛋白合成时双链打开才能进行翻译。

　　QβRNA的翻译、复制受寄主细胞调节，以正链RNA为模板复制负链RNA时，另需寄主细胞的HFⅠ和HFⅡ因子。而以负链RNA 为模板复制正链RNA时，不需这两个因子，感染后期大量合成的是正链RNA。

　　二、 病毒RNA复制的主要方式

　　1、 正链RNA病毒(mRNA)：噬菌体Qβ、灰质炎病毒等。

　　进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。

　　2、 负链RNA病毒(带有复制酶)：狂犬病毒等

　　此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA(mRNA)，再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。

　　3、 双链RNA病毒(带有复制酶)：呼肠孤病毒等

　　以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA(mRNA)，从而翻译出蛋白质，然后合成负链RNA，形成双链RNA，再包装。

　　4、 反转录病毒(含反转录酶)：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒

　　正链RNA病毒，它们的复制需要经过DNA前病毒阶段。

　　RNA生物合成的抑制剂

　　某些核酸代谢的拮抗物和抗生素可抑制核苷酸或核酸的合成，因而可以用于抗病毒或抗肿瘤药物，也可以用于核酸的研究

　　一、 嘌呤和嘧啶类似物

　　抑制核苷酸的合成，还能掺入核酸分子中去，形成异常DNA、RNA，影响核酸功能。

　　主要有：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶。碱基类似物进入体内后需转变成相应的核苷酸，才表现出抑制作用。

　　二、 DNA模板功能的抑制剂

　　此类化合物能与DNA结合，使DNA失去模板功能，从而抑制其复制与转录。

　　1、 烷化剂

　　氮芥(二(氯乙基)胺的衍生物)、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺类。它们带有活性烷基，使DNA烷基化。

　　烷化位点：鸟嘌呤N7 ，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1

　　烷基化后，碱基易被水解下来，留下的空隙可干扰DNA复制或引起错误碱基掺入。带有双功能基团的烷化剂，可同时与DNA两条链结合，使双链DNA交联，从而失去模板功能。

　　环磷酰胺：肿瘤细胞中磷酰胺酶活化，生成活性氮芥。

　　苯丁酸氮芥：癌细胞酵解作用强，乳酸多，pH低，苯丁酸氮芥易进入。

　　2、 放线菌素D(对真核、原核细胞都起作用)

　　有抗菌和抗癌作用。

　　它可与DNA形成非共价复合物，使其多肽部分在DNA的“浅沟”上如同阻遏蛋白一样，抑制DNA的转录和复制。

　　此类机理的放线菌素还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。

　　3、 嵌入染料

　　扁平芳香族染料，可插入双链DNA相邻碱基对之间。

　　溴化乙锭插入后，使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变，并能抑制RNA链的起始及质粒的复制。此外还有原黄素、吖啶黄、吖啶橙等。

　　三、 RNA聚合酶的抑制物

　　1、 利福霉素

　　包括其衍生物利福平，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性。

　　强烈抑制革兰氏阳性菌和结核杆菌，它主要抑制RNA合成的起始。

　　2、 利链菌素

　　与细菌RNA聚合酶β亚基结合，抑制转录过程中链的延长。

　　3、 α-鹅膏蕈碱

　　主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，对细菌的RNA聚合酶作用极小。