(三) 解螺旋酶

　　大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。

　　解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。

　　(四) DNA旋转酶

　　属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

　　拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。

　　拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。

　　拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。

　　(五) 单链DNA结合蛋白(SSB)

　　复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。

　　(六) DNA连接酶(ligase)

　　连接双链DNA上的切口。

　　大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。

　　E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。

　　(七) DNA复制的拓扑结构

　　四、 DNA的半不连续复制

　　DNA的半不连续复制

　　DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。

　　前导链：延伸方向与复制叉移动方向相同的子代DNA链。

　　滞后链：延伸方向与复制叉移动方向相反的子代DNA链。

　　1968年，发现冈崎片段。长度：

　　细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。

　　真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。

　　五、 DNA复制过程(E.coli.)

　　大肠杆菌的复制体结构示意图

　　1、 复制的起始

　　引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。

　　引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子(dnaB、dnaC、n、n'n''I)构成的复合体，负责RNA引物的合成。

　　引发体沿着模板链5’→3’方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同)，移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

　　E.coli.DNA复制原点ori C，由245bp组成，三组13bp重复序列(近5，端处)，四组9 bp重复序列(另一端处)。

　　大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：

　　DNaA 在原点处打开双螺旋

　　DNaB 使DNA解旋

　　DNaC DNaB结合在原点所需

　　Hu 刺激起始

　　引物酶(DNaG) 合成RNA引物

　　SSB 结合单链DNA

　　RNA聚合酶 促进DNaA活性

　　旋转酶 松驰DNA扭曲应力

　　20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。

　　三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。

　　DnaB(在DnaC协助下)与开放复合物结合，进一步解链。

　　2、 DNA链的延长反应

　　前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。

　　复制体：在DNA合成的生长点(既复制叉上)分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。

　　复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。

　　3、 RNA引物的切除及缺口补齐

　　DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。

　　DNApolⅠ的5， → 3，合成活性补齐缺口。

　　4、 DNA切口的连接

　　DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。

　　5、 DNA合成的终止

　　环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。

　　u 小结：

　　⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。

　　⑵ SSB结合于DNA单链。

　　⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

　　⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。

　　⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。

　　⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。

　　⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。

　　DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。

　　六、 真核生物DNA的复制

　　1、 复制起点和单位

　　真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA(单复制子)小得多。

　　★试验证据：5-氟脱氧胞苷标记

　　真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟1-3Kb，细菌每分钟5Kb。

　　真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。

　　2、 复制过程中组蛋白的装配

　　核小体的结构(200bp左右)

　　在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。

　　3、 真核生物DNA复制的终止

　　端粒：一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。

　　功能：

　　⑴保证线性DNA的完整复制

　　⑵保护染色体末端

　　⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。

　　端粒(telomeres)分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列，形式为：5，(TxGy)n3，(AxCy) n，x和y一般为1—4。

　　端粒末端的重复序列，通过端粒酶(telomerase)将其加到染色体末端。

　　端粒酶含有RNA和蛋白质(起DNA聚合酶的作用)两种组分，RNA分子约159b，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。

　　人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。

　　七、 DNA复制的调控

　　八、 DNA复制的真实性

　　生物体DNA复制具有高度真实性，复制10-7-10-11碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2 。

　　1、 DNA聚合酶对碱基的选择作用

　　酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP能长时间停留，而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。

　　酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。

　　动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。

　　DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板—引物，另一种是dNTP。

　　DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。

　　2、 3，→5，外切活性的校正阅读

　　E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。

　　缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。

　　3、 影响DNA合成真实性的因素

　　⑴高浓度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP)

　　NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3，→5，外切活性。

　　⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。

　　⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子(如Mn2+)代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3，→3，外切活性。

　　4、 为什么用RNA引物

　　⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配

　　⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。

　　DNA的损伤及修复

　　DNA的损伤：一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体(TT)，两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体(CT、CC)，使复制、转录受阻。

　　细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。

　　一、 直接修复

　　1949年已发现光复活现象，可见光(最有效400nm)可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。

　　A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D. 修复后释放酶

　　二、 切除修复

　　在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。

　　I、结构缺陷的修复：

　　(1)核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。

　　(2)核酸外切酶切除损伤的DNA。

　　(3)DNA聚合酶修复。

　　(4)DNA连接酶连接。

　　切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。

　　在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去，但相当于被稀释了。因为受损伤的链没有增加。

　　四、 易错修复和应急反应(SOS反应)

　　诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。

　　RNA指导的DNA合成(反转录)

　　反转录(reverse transcription)：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。

　　1970年，Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒(劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。

　　放线菌素D(抑制以DNA为模板的反应，复制和转录)能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader 用嘌呤霉素(puromycin)来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒(RSV)，证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。

　　一、 反转录酶

　　由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。

　　(1)RNA指导的DNA聚合酶活力(以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNA—DNA杂种分子)。

　　(2)RNase H酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。

　　(3)DNA指导的DNA聚合酶活力。

　　模板：RNA或DNA

　　以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。

　　引物：RNA或DNA

　　底物：dNTP

　　二价阳离子：Mg2+或Mn2+

　　真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。

　　二、 病毒RNA的反转录过程

　　所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒(retrovirus)，反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体(前病毒)。

　　1、 反转录病毒的基因组结构

　　(1) 反转录病毒基因组通常由两条相同的(+)RNA链组成。5’端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。

　　(2) 每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。

　　(3) 5’端有帽子结构，3’端有polyA，与真核mRNA相似。

　　(4) 5’端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro

　　2、 反转录过程。

　　当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使RNA反转录成双链DNA。

　　(1) 以病毒(+)RNA为模板，合成互补的(-)DNA。

　　(2) 切除RNA—DNA杂种分子中的RNA。

　　(3) 以(-)DNA链为模板，合成(+)DNA链，最后形成两端带有LTR(长末端重复序列)的双链DNA。

　　反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才能被转录，转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA。LTR(长末端重复序列)对前病毒DNA整合到宿主染色体DNA以及整合后的转录均起着重要作用。

　　反转录病毒合成的过程：缺口的模板(基因组)RNA，在U3旁生成一个正链DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。正链DNA合成开始，复制。

　　3、 反转录病毒的生活周期

　　(1) 病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。

　　(2) RNA被反转录成双链DNA(前病毒)，环化，进入细胞核。

　　(3) 反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。

　　(4) 前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。

　　(5) 基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。

　　三、 反转录的生物学意义。

　　1.反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。

　　2.艾滋病毒(AIDS)

　　人类免疫缺陷病毒(HIV)，也是一种反转录病毒，主要感染T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径100nm，球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白(gp120、gp41)，另有两层衣壳蛋白p24、p18。

　　HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个链长9.7kb，RNA 5，端有帽子结构，3’端有PolyA，链上结合有反转录酶。

　　3.乙肝病毒

　　大蛋白、中蛋白、主蛋白(表面抗原)

　　核心抗原

　　双链环状DNA

　　4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程

　　真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。

　　逆假基因：无启动子和内含子，但有polyA的残基，推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去的。

　　逆基因：具有启动子和转录功能，无内含子。可能是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子的下游处，或者是带启动子的RNA序列反转录后整合到基因组中

　　DNA合成技术

　　一、 cDNA合成

　　1、 cDNA文库的构建

　　cDNA：以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成的第二链。

　　cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的mRNA无内含子。

　　(1)、 真核mRNA的分离纯化

　　(2)、 cDNA合成(反转录酶)

　　(3)、 cDNA与载体连接

　　(4)、 重组体的转化

　　(5)、 扩增、保存

　　2、 获取特定mRNA的cDNA

　　(1)免疫法分离特定的mRNA

　　(2)PCR法

　　二、 PCR技术(聚合酶链式反应)Polymerase chain Reaction

　　以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。

　　它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。

　　1、 反应物

　　(1)模板

　　单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。

　　(2)Taq DNA聚合酶

　　DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌(Thermus aquaticns VT-1)分离出来。

　　Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。

　　(3)引物

　　引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30个b

　　(4)核苷酸dNTP

　　dNTP的浓度50-200umul/L。

　　(5)镁离子Mg2+

　　2、 PCR原理

　　变性 95℃

　　复性 55℃

　　延伸 72℃