第十章 DNA的生物合成

　　生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。

　　1958年，F.Crick提出中心法则：

　　(1)以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。

　　(2)以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。

　　(3)以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。

　　中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。(实际上10、11、12这三章分别讲述了中心法则的三个主要环节)

　　DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录

　　DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒(环状，双链)、真核细胞器DNA(线粒体、叶绿体)、病毒(双链，环状)

　　DNA的体外复制：分子克隆。

　　一、DNA的复制

　　1、 DNA半保留复制

　　在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成的。

　　1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，然后密度梯度离心，证明了DNA的复制是半保留复制。

　　1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。用3H-脱氧胸苷标记E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。

　　DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。

　　二、 复制起点、单位和方向

　　DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。

　　1、 复制起点

　　复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上(如D环复制)。 在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈(甲醛变性实验)的区段，即经常开放的区段，富含A.T。

　　2、 复制单位

　　复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。

　　原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制(一条链复制后才进行另一条链的复制)。

　　环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。

　　真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。

　　病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。

　　3、 复制方向

　　定点起始，复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行)，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。

　　4、 DNA的几种复制方式

　　(1)、 直线双向复制

　　单点，双向，T7

　　多点，双向，真核染色体DNA

　　(2)、 θ型复制：环状双链DNA，单向或双向(E .coli.)

　　(3)、 滚环复制：环状单链DNA，Φx174

　　(4)、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA

　　(5)、 多复制叉复制：

　　第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。

　　在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。

　　三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子

　　目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制

　　(一) DNA的聚合反应和聚合酶

　　DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，

　　1、 DNA聚合反应必备的条件

　　⑴ DNA聚合酶

　　⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)

　　⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质)

　　⑷ 4种dNTP

　　⑸ Mg2+

　　2、 聚合反应过程及特点

　　总反应式：

　　n1dATP DNA pol . dAMP

n2dGTP +DNA dGMP DNA+(n1+n2+n3+n4)PPi

　　n3dCTP Mg2+ dCMP

　　n4dTTP dTMP

　　在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。

　　DNA聚合酶的反应特点：

　　⑴ 以4种dNTP为底物

　　⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。

　　⑶ 反应需有引物3，-羟基存在

　　⑷ 链生长方向5， → 3，

　　⑸ 产物DNA的性质与模板相同

　　3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型

　　(1) 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3'羟基端回折成引物链。

　　(2) 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端突出作为模板。

　　(3) 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。

　　(4) 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。

　　4、 E.coli DNA聚合酶

　　(1)、 E.coli. DNA pol.I(Kornberg酶，400 copy/cell)

　　单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ

　　催化活性：

　　5， → 3， 聚合活性

　　3， → 5， 外切活性

　　5， → 3， 外切活性

　　用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：

　　大片段(Klenow)，75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。

　　小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复)。

　　Klenow片段的用途：

　　a 补齐DNA 3，隐缩未端

　　b. 标记DNA片段未端

　　c.cDNA合成第二链

　　d.d DNA测序

　　(2)、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ(100 copy/cell)

　　单体酶，分子量120Kd

　　催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)

　　3，→ 5，外切

　　可能在DNA的修复中起某中作用。

　　(3)、 E.coli.DNA pol.Ⅲ(复制酶，10-20 copy/cell)

　　寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。

　　DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)

　　Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链DNA。

　　★DNA聚合酶有6个结合位点

　　⑴ 模板DNA结合位点

　　⑵ 引物结合位点

　　⑶ 引物3，-OH位点、反应位点

　　⑷ 底物dNTP结合位点

　　⑸ 5， → 3， 外切位点(pol.Ⅱ没有)

　　⑹ 3， → 5， 外切位点(校正)

　　5、 真核生物DNA聚合酶

　　真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。

　　⑴ DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶。

　　⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。

　　⑶ DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。

　　⑷ DNA聚合酶δ，特点：有3， → 5，外切活力

　　(二) 引物酶或RNA聚合酶(引发酶)

　　细胞内，DNA的复制需要引物(DNA或RNA)，引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。

　　★DNA复制为什么要用RNA引物?(为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物?)

　　⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配

　　⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。