16. 真菌的检验方法： 镜检真菌形态、抗原检测、分离培养与鉴定、核酸检测、毒素检测

　　真菌标本直接检查

　　(1)真菌的直接涂片检查

　　2. 抗原检测：采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。

　　(2)常用的染色方法：

　　① 常用的染色方法有革兰染色、瑞氏染色、荧光染色，乳酸酚棉蓝染色、还有墨汁负染色等。② 对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。③ 检测病人脑脊液标本中新生隐球菌，需作墨汁负染色后检查，背景为黑色，新生隐球菌和荚膜不着色。

　　(3)直接镜检意义

　　A. 阳性结果意义

　　1.有诊断意义，如浅部真菌病、隐球菌病、皮肤粘膜假丝酵母菌病等;

　　2.代表组织相，直接镜检看到的真菌形态就是该真菌的组织形态，如假丝酵母的菌丝、浅部真菌的厚膜孢子等;确定某些致病性真菌属或种，如皮肤癣菌、曲霉等;

　　3.判断某些真菌种的致病性等;

　　B. 直接镜检局限性

　　1.阴性结果不能排除真菌感染，直接镜检不如培养敏感，其敏感性随标本类型、数量、采集时间和质量等而有所不同;

　　2.有假阳性结果，如溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁湿片中易误认为新生隐球菌;脂肪微滴也可与出芽酵母细胞混淆;

　　(3)真菌的分离培养：① 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。② 培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关。③ 大多数真菌培养的温度为28℃，但深部真菌为37℃。对二相性真菌培养时,28℃培养真菌呈菌丝相(霉菌型)，37℃培养为组织相(酵母型)。

　　(4)真菌培养方法： ① 平皿培养：表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。 ② 大试管培养：水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。③ 玻片培养(微量培养、小培养)：可用于真菌菌种的鉴定。

　　(5)观察菌落形态时注意：

　　1.菌落性质，是酵母菌还是霉菌。

　　2.菌落大小,一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大。

　　3.菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。

　　4.致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉;致病性真菌有时使培养基开裂，但污染霉菌很少引起培养基开裂。

　　(6)真菌鉴定：

　　A. 菌种鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是远远不够的，还需作生化反应，分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。

　　B. 检验真菌常用的生化反应有糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。

　　17. 抗真菌药物分类

　　(1)化学结构分类：

　　1.多烯类抗生素，如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。

　　2.吡咯类，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。

　　3.其他类如氟胞嘧啶。

　　(2)作用机理分类

　　1.作用于真菌细胞膜：两性霉素B、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。

　　2.作用于真菌细胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬净及普拉米星(pradimicin)等。

　　3.作用于真菌核酸：干扰真菌DNA合成，5-氟尿嘧啶(5-FC)等。

　　4.其他：大蒜新素(allitridum)及冰醋酸(glaciale acetic acid)等。

　　18. 临床常用抗真菌药物：

　　(1)两性霉素B：两性霉素对大多数深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隐球菌、曲菌、组织胞浆菌、双向真菌等均有较强的抑制作用。但对皮肤和毛发癣菌大多耐药。

　　(2)酮康唑：对念珠菌、着色真菌属、球孢子菌属等有抗菌活性，对毛发癣菌亦具抗菌活性。

　　(3)氟康唑：对念珠菌、隐球菌 具有较高抗菌活性。

　　(4)氟胞嘧啶：为窄谱抗生素，对念珠菌、新型隐球菌和:球拟酵母有较高抗菌活性，对其他真菌抗菌作用差，易产生耐药性，故常和两性霉素B联合使用。

　　(5)伊曲康唑：伊曲康唑体外有广谱抗真菌活性。对念珠菌、隐球菌、曲霉菌、组织胞浆菌、马内非青霉均有效。

　　(6)伏立康唑： 伏立康唑适用于侵袭性曲霉病及严重真菌

　　感染不能耐受其他药物或经其他药物治疗无效者，如足放线病菌属、镰刀菌属等感染。

　　19. 抗真菌药物药敏试验原则：

　　1.提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法

　　2.和体内的活性具有相关性，可预测治疗的效果

　　3.可用来监控敏感群体菌株的耐药性发生

　　4.可预期研究新药的潜在治疗效能。

　　20. 真菌药物敏感试验过程：

　　(1)方法：肉汤稀释法，包括常量稀释法和微量稀释法。

　　(2)培养基：含谷氨酰胺和pH指示剂，不含碳酸氢钠RPMI 1640培养基。

　　(3)程序：药物原液配制——接种菌液制备——药液稀释——常量稀法——微量稀释法——结果判断——质量控制。

　　21. 真菌非培养检测技术

　　(1)动物试验: 分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。

　　(2)核酸检测: 操作简便、省时省工、敏感性和特异性高的优点，但要一定的实验条件，并大多仍处于实验研究阶段，故目前不可能完全替代常规鉴定方法 。

　　(3)真菌毒素的检测: 生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法和间接竞争ELISA法等。

　　例题：

　　1.细菌的革兰染色性主要决定于：( )

　　A.核质结构 B.细胞壁结构 C.细胞膜结构

　　D.磷壁酸的有无 E.中介体的有无

　　2.溶原性细菌是指：( )

　　A.带有前噬菌体基因组的细菌 B.带有毒性噬菌体的细菌

　　C.带有温和噬菌体的细菌 D.带有R质粒的细菌

　　E.带有F质粒的细菌

　　3.能引起内毒素性休克的细菌成分是：( )

　　A.肽聚糖 B.磷壁酸 C.LPS D.菌体抗原 E.荚膜多糖

　　参考答案

　　1. B 2 . A 3. C