第二节 免疫毒理试验中常用的方法

　　为鉴定外来化合物对免疫系统的毒性，必须建立一系列灵敏、特异、简便、快速的检测方法，大多数免疫毒理学家认为，要建立一组实验方法来评价免疫毒性。

　　一、病理学常规检查

　　病理学检查对于评价外来化合物对免疫功能的影响十分有用。外来化合物接触实验动物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量或组织学的变化、淋巴组织及骨髓的细胞量或质的变化和外周血淋巴细胞数改变。因此为了观察化学物质对免疫功能的影响，首先可对免疫器官进行大体解剖观察，如果发现胸腺重量下降和胸腺发生萎缩，就应着重检查细胞免疫功能;有人观察到动物接触已烯雌酚、TCDD或环磷酰胺，胸腺重量与细胞免疫功能状况呈很好的正相关。

　　二、淋巴细胞增殖反应试验

　　淋巴细胞增殖反应试验是测定T细胞和B细胞功能活性的简便方法，重复性也较好。

　　检测方法有形态学方法、同位素掺入法和颜色反应法。颜色反应法测定活细胞及增殖细胞转化程度简单、快速，在对一定数量细胞测定时，具有与同位素掺入法同样的灵敏度，是一种常用的方法。

　　三、体液免疫功能检测

　　有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体滴度、抗体形成细胞(PFC)及B细胞受体试验等。

　　抗体形成细胞试验是一种敏感而且常用的方法。通常用的抗原有绵羊红细胞(SRBC)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(0valbumin)、脂多糖(LPS)等。

　　用琼脂单向扩散法测定人血清免疫球蛋白的含量，虽不很敏感，但却是很常用的方法。

　　四、细胞免疫功能检测

　　细胞免疫功能主要由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。

　　用来测定细胞免疫功能的方法有体内法(迟发型变态反应、移植物抗宿主反应、皮肤移植排斥反应)和体外法(淋巴细胞增殖、T细胞毒性及淋巴因子的产生)。

　　体内检测迟发型变态反应的方法应用较广，在一般情况下迟发型变态反应可以反映机体细胞免疫状况。原理是当致敏的T细胞再次接触相应的抗原后，就能引起局部的致敏淋巴细胞释放出多种淋巴因子，导致以单核细胞浸润为主的炎症反应，表现为皮肤红肿硬结。这种反应一般在抗原注射后24～48小时可以见到。

　　在人体检测迟发型变态反应可采用皮试法。皮试法中所用的抗原有特异性病原微生物性抗原，如结核菌素(OT)、白喉病毒、腮腺炎病毒等;还有非特异性抗原，如二硝基氯苯、二硝基氟苯及植物血凝素等。结果判定是根据硬结的纵横直径平均值，一般在5mm以上为阳性反应。

　　动物迟发型变态反应检测常用绵羊红细胞(SRBC)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(0valbumin)等。在用绵羊红细胞作为抗原时，一般致敏剂量为l x 108个细胞，致敏注射部位可在背部皮下注射或腹腔注射，经过5天后用l x 108个/20ul的SRBC注射一侧足掌，另一侧足掌注射生理盐水。24小时后用精密卡尺测量双侧足垫的厚度，并以双侧足垫厚度的差值来表示。

　　五、巨噬细胞功能试验

　　巨噬细胞在免疫反应中具有很重要的作用，它不仅有非特异性吞噬功能，还参与细胞免疫和体液免疫。巨噬细胞有多种功能，例如吞噬作用、胞内杀伤、抗原摄取和处理、产生干扰素以及对感染细胞或恶变细胞的杀死和溶解作用等。

　　可通过测定体内对异物的清除率、体内和体外对细菌及细胞的吞噬作用、对肿瘤细胞的生长抑制能力来评价巨噬细胞的功能。

　　六、 宿主抵抗力试验

　　机体在接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般认为，B细胞缺损，机体对细菌敏感性升高;T细胞缺损，则对病毒、寄生虫、肿瘤敏感性增高。这种试验是在动物身上进行的整体试验。

　　1.肿瘤细胞攻击试验 本试验用纯系小鼠观察机体对同系基因的肿瘤细胞的抵抗力。攻击所用的肿瘤细胞量是使10%～20%正常动物发生肿瘤的量。观察指标为肿瘤发生率、死亡率、发生肿瘤的平均潜伏期、肿瘤大小、结节数目以及平均死亡时间等。

　　2.对传染源的抵抗试验 在免疫毒性试验中常用的传染源有病毒、细菌、寄生虫。实验选用传染源时需考虑以下方面，它对人类或其它动物的危险性;动物是否易感;产生的病变是否有重复性;机体防御机制中是否需要T或B细胞参与;感染过程是否易于观察。最常用的指标是死亡率。接种剂量应相当于在正常小鼠产生死亡率为10%～20%的剂量。常用的病毒有：脑炎—心肌炎病毒(EMC病毒)、单纯疱疹性病毒(HSV)、流感A型病毒(FLU病毒)等。常用的细菌有李斯特菌和绿脓杆菌。常用的寄生虫有毛线虫和疟原虫。

　　例题：

　　【A 型题】

　　1.胚胎毒性作用是 A

　　A.生长迟缓，功能缺陷

　　B.生长迟缓，致畸作用

　　C.功能缺陷，致畸作用

　　D.致畸作用，致死作用

　　2.大鼠致畸试验中的给药时间是受精后 D

　　A.7~16天

　　B.8~16天

　　C.9~16天

　　D.9~17天

　　E.8~17天

　　3.致畸作用的敏感期是 B

　　A.着床期

　　B.器官发生期

　　C.胎儿期

　　D.胚泡形成期

　　4.致畸作用的毒理学特点是 A

　　A.有致畸敏感期，计量反应关系曲线陡峭，物种差异明显

　　B.无致畸敏感期，计量反应关系曲线陡峭，物种差异明显

　　C.有致畸敏感期，计量反应关系曲线平缓，物种差异明显

　　D.无致畸敏感期，计量反应关系曲线平缓，物种差异明显