三、外来化合物发育毒性的评价

　　致畸作用是发育毒性中最重要的一种表现，所以外来化合物发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。传统常规致畸试验是评定外来化合物是否具有致畸作用的标准方法，多年来很多国家和机构都采用和推荐这一方法。

　　(一)传统常规致畸试验(致畸试验)

　　1.动物选择

　　致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。

　　根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数;而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对一般外来化合物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期初期，其胎盘具有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外来化合物，例如锥虫蓝可以干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性结果;而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，所以有时此种结果对人类为假阳性。

　　小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。

　　2.剂量分组

　　由于致畸作用的剂量效应(反应)关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为接近。因此在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量;同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡;较多母体死亡也应避免。

　　一般应先进行预试，预试的目的是找出引起母体中毒的剂量。

　　根据预试结果可以确定正式试验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状;中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。

　　一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为1/100～1/30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性试验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1/30为低剂量，可供参考。

　　每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在一般常规试验中，除设有3个剂量组和一个对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15 000IU维生素A剂量，或将每ml含50 000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1 ml剂量给大鼠灌胃。此外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。

　　3.动物交配处理

　　将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。准确确定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及确定进行检查的日期非常重要。

　　由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。

　　大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。如拟深入研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别给予一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后可以根据畸形出现的情况，确定受试物的主要靶器官。

　　接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。

　　试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常;如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。

　　4.胎仔检查

　　自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。

　　活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑;②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂;③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。

　　以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。

　　5.结果评定

　　在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形;如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应(反应)关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。

　　(1)活产幼仔平均畸形出现数： 即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。

　　(3)母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。

　　6.致畸物以及发育毒性作用物危险度评定

　　(1)欧共体(EEC)和经济合作与发展组织(OECD)建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：

　　1级，已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷;

　　2A级， 对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系;

　　2B级， 动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料;

　　3 级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足;

　　4级， 动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸

　　(2)致畸指数： 母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD50/胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。

　　(3)相对致畸指数(RTI)：成年动物最小致死剂量(LD01)与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量(tD05)之比值，即LD01/tD05。

　　(4)母体毒性与发育毒性比值：或称成年毒性与发育毒性比值，即对母体最低损害作用剂量(A)与胎仔最低损害作用剂景(D)之比(A/D)。一般认为A/D比值为3或3以上者，则具有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，3以下者，相对危险性较低或不具危险性。在一般情况下，大多数化合物A/D比值均在3以下，以及1～2范围内。关于母体和胎仔最低损害作用的具体表现，在母体主要为体重增长减少，出现某些临床症状以及死亡，对胎仔则为致畸以及其它发育毒性表现。