病毒感染的实验室诊断

　　病毒学实验诊断有三个方面：

　　①直接检测和分离鉴定;

　　②检测病毒蛋白抗原成分和核酸;

　　③检测抗体。

　　病毒感染的实验室诊断——标本采集、运送及处理

　　标本采集

　　(1)采样时机：应在病人急性期或发病初期采集标本。

　　(2)标本种类：根据不同病毒感染采集不同标本。

　　标本的运送及保存

　　大多数病毒抵抗力较弱，在室温中易被灭活，所以标本要快速运送，立即处理和接种。采集和运送保存均在4℃，长时间保存需置-70℃。

　　标本处理

　　根据不同种类的标本，运用不同的处理方法。

　　病毒感染的实验室诊断——分离培养与鉴定

　　分离培养

　　(1)组织培养：包括器官培养、组织块培养和细胞培养。针对不同的欲检测病毒，选择适当的培养细胞。细胞培养分：①原代和次代细胞培养;②二倍体细胞株;③传代细胞系。

　　(2)鸡胚接种：鸡胚常用于黏液病毒、疱疹病毒、痘类病毒等的原代分离。

　　(3)动物接种：常用新生小鼠或乳鼠进行病毒分离。根据病毒种类不同，需选择相应的敏感动物，还需接种相应的合适部位。

　　病毒鉴定

　　(1)初步鉴定：根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特征、理化性质可初步判断病毒的科及属。

　　(2)最终鉴定：在初步鉴定的基础上，选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定。常用的有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫试验等。

　　病毒感染的实验室诊断——病毒感染的诊断

　　显微镜检查

　　(1)用光学显微镜直接检查病毒包涵体。包涵体检查可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。

　　(2)用电子显微镜直接检查病毒颗粒，数小时即可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。应用免疫电镜灵敏度更高。

　　病毒抗原检查　利用特异性免疫血清检测标本中病毒抗原。

　　病毒抗体检查　利用特异性抗原检测病毒感染者血清中IgM和IgG抗体。IgM抗体出现在病毒感染的早期。IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或4倍以上时，才有诊断意义。

　　病毒核酸检测　利用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段。但检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。

　　呼吸道病毒：

　　流行性感冒病毒

　　副流感病毒

　　呼吸道合胞病毒

　　腺病毒

　　麻疹病毒

　　风疹病毒

　　冠状病毒

　　禽流感病毒

　　流行性感冒病毒——生物学性状

　　分节段的单负股RNA病毒。

　　形态：球形或丝状。

　　结构：

　　核心：由核酸和核蛋白组成。

　　基质蛋白(M蛋白)：保护核心与维持病毒外形。

　　包膜：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。

　　分型：

　　变异：流感病毒易发生变异，变异的物质基础是HA和NA，两者变异可同时出现，也可单独出现。

　　培养特性：

　　鸡胚接种培养;

　　原代猴肾细胞或犬肾传代细胞培养;

　　利用红细胞凝集试验确定病毒的存在。

　　抵抗力：不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。

　　流行性感冒病毒——微生物检验

　　标本采集和处理：

　　在发病急性期，以前三天为最好。合理采集相应标本，如鼻腔洗液、咽拭子、鼻拭子等，置于Hanks液中。低温运送保存。

　　分离培养与鉴定：

　　接种于鸡胚羊膜腔，收集羊水和尿囊液进行血凝试验、血凝抑制试验进行鉴定。

　　快速诊断：①免疫荧光技术和酶免疫技术。②分子杂交技术。③PCR技术。④免疫电镜技术。

　　血清学诊断：需同时检测急性期(5d以内)和恢复期(2～4周)血清，在相同条件下进行血凝抑制试验，如恢复期抗体效价比急性期高4倍或4倍以上即有诊断意义。

　　流行性感冒病毒——临床意义

　　副流感病毒——生物学性状

　　单负股RNA，不分节段。

　　包膜上嵌有两种糖蛋白刺突，一种为HN，具有血凝和神经氨酸酶活性，具有流感病毒HA的吸附作用;另一种为F，具有使病毒进入宿主细胞和使病毒在宿主细胞之间传播的作用。

　　副流感病毒抵抗力弱，不耐酸，对热敏感。

　　副流感病毒——微生物检验

　　标本采集和处理

　　分离培养：最敏感的细胞是原代人胚肾和原代猴肾细胞。

　　病毒鉴定：最常用的方法是红细胞吸附抑制试验，亦可用血凝抑制试验、中和试验和补体结合试验对病毒进行鉴定。

　　直接检测病毒抗原：间接免疫荧光法、ELISA、放射免疫和电镜技术。

　　血清学诊断

　　副流感病毒——临床意义

　　副流感病毒经感染者呼吸道分泌物通过人与人密切接触或气溶胶传播，可引起儿童和成人上呼吸道感染。

　　呼吸道合胞病毒——生物学性状

　　核酸为单负股RNA，不分节段。

　　球形，单个病毒颗粒具有多形性。

　　包膜上的G蛋白作用类似流感病毒的血凝素蛋白HA，包膜上的F蛋白是融合蛋白，介导病毒穿入和细胞融合。

　　呼吸道合胞病毒——微生物检验

　　标本采集和处理

　　分离培养与鉴定：不能在鸡胚中增殖，可在人类上皮细胞传代细胞系内增殖。细胞病变特点为合胞体形成即细胞融合成多核巨细胞，胞质内形成嗜酸性包涵体。

　　直接检测病毒抗原：免疫荧光技术、酶免疫技术。

　　血清学诊断：中和试验、免疫荧光试验和酶免疫试验检查血清中IgG、IgM及IgA。

　　呼吸道合胞病毒——临床意义

　　引起婴幼儿下呼吸道疾病的最常见的病毒。最常见的传播途径是经飞沫传染，最易引起婴幼儿细支气管炎和细支气管肺炎，较大儿童和成人主要引起上呼吸道感染。

　　腺病毒

　　中等大小的无包膜病毒，核心为单一线形双股DNA。可在细胞核中形成嗜碱性包涵体。

　　感染可常年流行，常引起呼吸道疾病，上呼吸道感染多见普通感冒、咽炎、扁桃体炎。下呼吸道疾病有支气管炎、细支气管炎和肺炎。也可引起其他器官感染。

　　麻疹病毒

　　病毒呈球形，核心为单负链RNA。

　　三种衣壳蛋白(L、P、N)。

　　包膜内面为M蛋白，包膜表面有血凝素(H蛋白)和融合蛋白(F);H蛋白与细胞表面病毒受体CD46结合，感染宿主。可在受感染细胞产生细胞融合和多核巨细胞，胞质和胞核内有嗜酸性包涵体。

　　儿童时期最常见的急性呼吸道传染病。飞沫传播，冬春季易发病。

　　病毒侵入上呼吸道和眼结膜上皮细胞内增殖。

　　麻疹病毒还可引起较为少见的远期并发症是亚急性硬化性全脑炎(SSPE)。

　　风疹病毒

　　球形，核心为单正链RNA。包膜表面有血凝素。

　　ELISA法检测血清特异性IgM可协助诊断。

　　风疹是全身麻疹样出疹伴耳后及枕下淋巴结肿大为特征的急性呼吸道传染病。病毒在局部淋巴结增殖后，通过病毒血症播散全身。孕妇在妊娠早期感染病毒，经胎盘垂直传播感染胎儿，可引起先天性风疹综合征。

　　冠状病毒

　　正链单股RNA病毒，含包膜。

　　鉴定方法：荧光免疫法，电镜检查法，核酸序列检测法等。

　　成人和较大儿童上呼吸道感染的重要病因。主要引起普通感冒和咽炎。大约10%～30%的普通感冒由该病毒引起。

　　SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征的病原体。近距离呼吸道飞沫传播。

　　禽流感病毒

　　禽流感病毒是甲型流感病毒的一种亚型，可引起禽流行性感冒。目前发现感染H5N1亚型的患者病情严重，致死率高。

　　采用鸡胚培养法分离病毒。也可作病毒抗原、抗体及核酸的检测。