第十七章　厌氧性细菌及检验

　　一、概述

　　厌氧菌的分类

　　厌氧菌的临床意义

　　厌氧菌感染

　　厌氧菌标本的采集与送检

　　厌氧菌的分离与鉴定

　　厌氧环境的指示

　　二、常见厌氧菌

　　破伤风杆菌

　　产气荚膜梭菌

　　肉毒梭菌

　　艰难梭菌

　　厌氧球菌

　　无芽胞厌氧菌

　　厌氧菌概述

　　一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。

　　G+有芽胞的梭菌：有芽胞，抵抗力强，广泛存在，可出芽繁殖，产生多种外毒素，引起严重疾病。

　　G+/G-无芽胞的球菌与杆菌：人体正常菌群，可存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等。致病性属条件致病性的内源性感染。

　　厌氧菌概述——分类

　　《伯杰系统细菌学手册》分类标准：

　　无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个菌种和亚种;而有芽胞的厌氧菌只有梭菌属，包括130个种。

　　据耐氧性分类

　　(1)专性厌氧菌：是指在降低氧分压的条件下才能生长的细菌。又分为极度厌氧菌(氧分压<0.5%，空气中暴露10min致死，如丁酸弧菌)和中度厌氧菌(氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存，如大多数人类致病厌氧菌)。

　　(2)微需氧菌：能在含5%～10%CO2空气中的固体培养基表面生长的细菌，如弯曲菌属。

　　(3)耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。一旦生长，暴露数小时仍不死亡，如第三梭菌、溶组织梭菌。

　　厌氧菌概述——临床意义及感染

　　感染类型

　　外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染。

　　内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。

　　感染的危险因素：

　　组织缺氧缺血;

　　机体免疫功能下降;

　　某些手术及创伤易发生厌氧菌感染;

　　长期应用某些抗菌药物;

　　深部需氧菌感染。

　　感染的临床指征：

　　感染局部产生大量气体;

　　多发生在黏膜附近;

　　深部外伤后继发感染;

　　分泌物有恶臭或为暗红色;

　　常见于长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效的病例;

　　镜检有细菌，常规培养阴性。

　　厌氧菌概述——标本的采集与送检

　　重要原则：标本绝对不能被正常菌群所污染;应尽量避免接触空气。

适宜标本	血液、骨髓、脑脊液、关节液、心包液、胸腔积液、腹腔液、胆汁、由活检或尸体解剖获得的组织标本、深部脓肿抽取物、经环甲膜以下或肺穿刺抽取的肺渗出物、后穹窿穿刺抽取的盆腔渗出液及无菌套管抽取的宫腔内容物、膀胱穿刺液及其它组织穿刺液等
不宜标本	鼻咽拭子、齿龈拭子、直肠拭子、喀出的痰液、自然排出的尿液和导出的尿液、流出的脓液、接近皮肤或黏膜的分泌物、阴道分泌物、胃和小肠内容物、粪便（艰难梭菌除外）等

　　厌氧菌概述——标本的采集与送检

　　采集

　　多采用针筒抽取、穿刺等，应严格无菌操作，严禁接触空气。

　　厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长。

　　送检

　　针筒运送：液体标本。

　　无菌小瓶运送：液体标本。

　　棉拭子运送：需使用特制运送培养基。

　　厌氧罐/厌氧袋运送：较大组织块或床边接种的培养皿等。

　　标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h。如不能及时接种，应室温保存。

　　厌氧菌概述——分离与鉴定

　　直接镜检

　　根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。

　　分离培养

　　初代培养和次代培养两个阶段。

　　初代培养的一般原则：

　　(1)先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择;

　　(2)尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基;

　　(3)最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基;

　　(4)尽量保证培养基新鲜;

　　(5)要考虑到微需氧菌存在的可能。

　　非选择培养基：心脑浸液琼脂(BHI)、布氏琼脂(BR)、胰豆胨肝粉琼脂(GAM)、胰胨酵母琼脂(EG)、CDC厌氧血琼脂等。

　　选择培养基：KVLB血平板(即上述非选择培养基中加卡那霉素和万古霉素)，KVLB冻溶血平板(产黑素类杆菌早期产生黑色素)，七叶苷胆汁平板(BBE，用于脆弱类杆菌)，FS培养基(梭杆菌选择培养基)，卵黄(EYA)及兔血平板(RBA)(用于产气荚膜梭菌)，CCFA培养基(艰难梭菌选择培养基)等。

　　分离培养

　　每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10% CO2环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。

　　厌氧培养法

　　(1)厌氧罐培养法

　　(2)气袋法

　　(3)气体喷射法

　　(4)厌氧手套箱培养法

　　(5)其他培养法

　　鉴定试验

　　1.形态、染色

　　2.菌落性状

　　3.抗生素敏感性鉴定试验：常用卡那霉素及甲硝唑。

　　4.生化特性：主要包括糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。

　　5.气-液相色谱：分析厌氧菌的终末代谢产物。

　　厌氧状态的指示

　　1.化学法：亚甲蓝和刃天青。

　　无氧时均呈白色，有氧时亚甲蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。

　　2.微生物法：专性需氧菌。

　　破伤风杆菌——生物学特性

　　形态与结构

　　形态：细长;呈鼓槌状。

　　染色：G+;培养48h后，尤其芽胞形成后易转变为G-。

　　特殊结构：有周鞭毛，无荚膜;芽胞在菌体顶端，呈圆形。

　　破伤风杆菌——生物学特性

　　培养特性

　　营养要求：较高。

　　气体环境：专性厌氧菌。

　　菌落特征：

　　普通培养基上不易生长。

　　血平板：37℃ 48h形成扁平、灰白色、半透明、边缘不齐的菌落。

　　疱肉培养基：肉渣部分消化，微变黑。

　　抗原

　　有菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原。鞭毛抗原有型特异性，可分为10个血清型。各型菌所产生的毒素的生物活性与免疫活性均相同，可被任何型的抗毒素中和。

　　抵抗力

　　繁殖体的抵抗力与其他细菌相似，但芽胞体抵抗力非常强。

　　破伤风杆菌——微生物检验及鉴定

　　破伤风的临床表现典型，根据临床症状即可作出诊断，所以一般不做细菌学检查。

　　(1)特殊需要时，可从病灶处取标本涂片，革兰染色镜检。

　　(2)需要培养时，将标本接种血平板、疱肉培养基培养。

　　(3)生化试验：

糖类发酵试验	H2S试验	明胶液化试验	硝酸盐还原试验	吲哚试验
-	+	+	-	+

　　(4)也可进行动物试验。

　　破伤风杆菌——致病性及临床意义

　　所致疾病：破伤风。

　　产气荚膜梭菌——生物学特性

　　形态与结构

　　形态：粗大杆菌。

　　染色：G+。

　　特殊结构：

　　无鞭毛;在机体内可形成明显的荚膜。

　　芽胞呈椭圆形，次极端。体内不形成芽胞，体外培养也很少形成芽胞，只有在无糖培养基上方可形成。

　　培养特性

　　营养要求：较高。

　　气体环境：不严格厌氧菌。

　　温度环境：20～50℃均能生长，最适温度为45℃。

　　菌落特征：取坏死组织制成悬液，接种血平板，多数菌株有双层溶血环。

　　疱肉培养基：可分解肉渣中的糖类而产生大量气体。

　　牛乳培养基：能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，出现“汹涌发酵”现象。

　　产气荚膜梭菌——微生物检验及鉴定

　　(1)直接涂片镜检：在创口深部取材涂片，革兰染色镜检。

　　(2)分离培养及鉴定：可取坏死组织制成悬液，接种血平板或疱肉培养基中厌氧培养，取培养物涂片镜检，利用生化反应进行鉴定。

　　(3)生化试验：

糖类发酵试验	H2S试验	明胶液化试验	卵磷脂酶试验
分解多种糖类，产酸产气	+	+	+

　　产气荚膜梭菌——致病性及临床意义

　　致病物质：

　　外毒素：α毒素为主，本质为卵磷脂酶。

　　侵袭酶类：透明质酸酶、DNA酶等。

　　所致疾病：

　　气性坏疽：组织坏死、水肿胀气、全身中毒。

　　食物中毒：某些A型菌株产生的肠毒素引起，可自愈。

　　肉毒梭菌——生物学特性

　　形态与结构

　　形态：短粗;呈汤匙状或网球拍状。

　　染色：G+。

　　特殊结构：

　　有周鞭毛，无荚膜。

　　芽胞呈椭圆形，粗于菌体，位于次极端。

　　培养特性

　　营养要求：一般。

　　气体环境：严格厌氧。

　　菌落特征：可在普通琼脂平板和血平板上生长。

　　血平板：β溶血。

　　疱肉培养基：消化肉渣使之变黑，有腐败恶臭。

　　抗原

　　根据所产生毒素的抗原性不同，肉毒梭菌可分为8个型，引起人类疾病的以A、B型最为常见。

　　抵抗力

　　芽胞体抵抗力很强。肉毒毒素对酸的抵抗力比较强，可在胃液24h不被破坏，可被胃吸收。但肉毒毒素不耐热，煮沸1min即可被破坏。

　　肉毒梭菌——微生物检验及鉴定

　　(1)直接涂片镜检

　　(2)分离培养及鉴定

　　(3)生化试验：

糖类发酵试验	H2S试验	明胶液化试验	脂酶试验	吲哚试验
分解葡萄糖麦芽糖	+	+	+	-

　　(4)肉毒毒素检测：可取培养滤液或悬液上清注射小鼠腹腔，观察动物出现的中毒症状。

　　肉毒梭菌——致病性及临床意义

　　致病物质

　　肉毒毒素：毒性强(毒性最强的细菌毒素)，导致肌肉麻痹。

　　所致疾病

　　食物中毒：属单纯性毒性中毒，并非细菌感染。胃肠症状很少见，主要表现为某些部位的肌肉麻痹，重者可死于呼吸困难与衰竭。

　　婴儿肉毒病

　　艰难梭菌——生物学特性

　　形态与结构

　　形态：粗长杆菌。

　　染色：G+。

　　特殊结构：

　　有鞭毛，无荚膜，次极端有卵圆形芽胞。

　　艰难梭菌——微生物检验及鉴定

　　分离培养困难：严格厌氧;需特殊培养基。

　　CCFA平板上菌落：黄色，粗糙型。

　　在紫外线照射下呈黄绿色荧光。

　　生化试验

糖类发酵试验	H2S试验	卵磷脂酶试验	脂酶试验	吲哚试验
分解葡萄糖果糖	-	-	-	-

　　临床上一般不采用分离培养病原菌的方法。

　　通过临床表现及细胞毒素试验阳性检测来进行诊断。

　　艰难梭菌——致病性及临床意义

　　致病物质

　　毒素A：肠毒素。可使肠壁出现炎症，通透性增加，出血及坏死。

　　毒素B：细胞毒素。直接损伤肠壁细胞，因而导致腹泻及假膜形成。

　　本菌感染与大量使用抗生素有关，如阿莫西林、头孢菌素和克林霉素等，其中以克林霉素尤为常见。

　　所致疾病

　　伪膜性肠炎：重症患者水样便中可出现斑片状假膜。

　　抗生素相关性腹泻

　　G+厌氧杆菌有7个属

	形态	特殊结构	培养特性	临床意义
丙酸杆菌属	小	无鞭毛	普通培养基	正常菌群 条件致病菌 内源性感染
双歧杆菌属	多形性有分枝	无鞭毛 无荚膜	严格厌氧 耐酸
优杆菌属	多形		严格厌氧 生长缓慢
乳杆菌属	细长	无荚膜 无鞭毛	专性厌氧 兼性厌氧 微需氧

　　厌氧性球菌——分类

　　G-厌氧球菌：3个属，以韦荣菌属最重要。为咽喉部主要厌氧菌。

　　G+厌氧球菌：5个属，有临床意义的是消化球菌属、消化链球菌属。

　　无芽胞厌氧菌——临床意义

　　人体的正常菌群，条件致病引起内源性感染。所致疾病有：

　　1.败血症　主要由脆弱类杆菌引起。

　　2.中枢神经系统感染　主要由G-厌氧杆菌引起。

　　3.口腔与牙齿感染　主要由消化链球菌等引起。

　　4.呼吸道感染　主要由坏死梭杆菌、消化链球菌和脆弱类杆菌等引起。

　　5.腹部和会阴部感染　主要由脆弱类杆菌引起。

　　6.女性生殖道感染　主要由消化链球菌、普雷沃菌等引起。

　　7.其他　无芽胞厌氧菌尚可引起皮肤和软组织感染、心内膜炎等。

	芽胞厌氧菌（梭菌属）	无芽胞厌氧菌
形态染色	G+大杆菌，有芽胞	G+/G-，球菌/杆菌
存在部位	土壤/人和动物肠道	正常菌群
分离培养	厌氧培养	厌氧培养
致病条件	外源性感染 外毒素致病，特定病型 厌氧伤口/消化道	内源性感染 条件致病，无特定病型 多为化脓性感染
微生物学检查	特定病型可诊断	必须，药敏试验
防治原则	类毒素/抗毒素/抗生素	防止感染条件发生，药敏指导下使用抗生素

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