离心技术

　　(一)离心技术的基本原理

　　离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。

　　离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。

　　制备离心技术主要用于物质的分离、纯化。

　　分析离心技术主要用来分析样品的组成。

　　(二)离心技术种类及在检验中的应用

　　离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：

　　①对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等;

　　②分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。

　　1.普通离心法

　　可用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。

　　2.差速离心法(差级离心法)

　　其原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

　　适合分离大小和密度差异较大的颗粒。

　　由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。

　　3.密度梯度离心法

　　该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。

　　做法：将样品放在密度梯度介质中进行离心。

　　常用的梯度材料有蔗糖、甘油、KBr、CsCl等。

　　此法可分为：速率区带离心法;等密度区带离心法。

　　密度梯度离心示意图

　　(1)速率区带离心法

　　根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

　　一般用于分离大小相异而密度相同的物质。

　　(2)等密度区带离心法

　　离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶部或与梯度液混合，当梯度液由于离心力作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。

　　此法常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。

　　4.分析性超速离心

　　主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，如测定大分子的相对分子量、生物大分子的纯度估计、分析生物大分子中的构象变化等。

　　四、层析技术

　　(一)层析技术的原理

　　层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。

　　所有的层析系统都由两个相组成：

　　固定相：大多是固体物质或是固定于固体上的成分。

　　流动相：由水和各种溶媒组成(液体或气体)。

　　当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同，在两相中的分配(含量比)不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。

　　分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。

　　(二)层析法分类

固定相            流动相	液体	气体
液体	液-液层析	气-液层析
固体	液-固层析	气-固层析

　　按层析原理还可将层析分为：凝胶层析、离子交换层析、高 效液相层析、亲和层析。

　　1.凝胶层析

　　又称分子筛过滤或排阻层析等。

　　固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度(移动速度)也不同。

　　优点：所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。

　　常用的凝胶有Sephadex G(葡聚糖凝胶)系列。

　　凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。

　　2.离子交换层析

　　采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。

　　主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。

　　3.高 效液相层析

　　在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快  速的分离技术。

　　具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤 其有利。

　　根据流动相和固定相相对极性，高 效液相色谱分析可分为正相和反相两种。

　　4.亲和层析

　　利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。

　　将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质才能被固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。

　　改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。

　　亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。

　　具有专一亲和力的生物分子对主要有：

　　抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物，激素与受体，维生素与特异结合蛋白，糖蛋白与植物凝集素等。

　　亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。

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