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2020临床医学检验技士《免疫检验》第二十章:免疫检验自动化仪器分析

来源 :中华考试网 2019-10-10

  第二十章 免疫检验自动化仪器分析

  第一节 自动化免疫浊度分析系统

  免疫浊度分析属液相沉淀试验,其基本原理是抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应,形成小分子免疫复合物(<19S),在增浊剂(如PEG、NaF等)的作用下,迅速形成免疫复合物微粒(>19S),使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下,形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加,反应液的浊度亦随之增大,即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。

  一、免疫透射比浊法

  (一)原理

  可溶性抗原抗体反应后形成的免疫复合物,使介质浊度发生改变,光线通过抗原抗体反应后的溶液时,被其中的免疫复合物微粒吸收,在保持抗体过量的情况下,吸光度(A值)与免疫复合物量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品相比较,可确定标本中抗原的含量。

  仪器工作过程

  1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。

  2.将待测标本和标准抗原溶液(5个浓度抗原标准品)与适当过量的抗血清混合,在一定条件下,抗原抗体反应完成后,在340nm处测定各管吸光度。

  3.按方程进行曲线拟合,制备剂量-反应曲线,由计算机处理,计算出抗原浓度。

  (二)方法评价

  1.优点:灵敏度比单扩法高,操作简便,结果准确,且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测。

  2.不足:①抗体用量较大;②溶液中IC分子若过小则阻挡不了光线的通过;若数量太少则对光通量影响不大;灵敏度较散射比浊法低;③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段,检测需在抗原-抗体反应达到平衡后进行,耗时较长。

  二、免疫胶乳比浊法

  (一)原理

  用抗体致敏胶乳颗粒,在遇到相应抗原时,形成IC,引起胶乳颗粒凝聚。抗原-抗体反应后溶液的吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关。采用透射比浊法或散射比浊法测定。

  (二)方法评价

  本法敏感度高于普通比浊法,可达ng/L水平,操作简便,易自动化;

  血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合,使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集,用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰,又可克服IgG致敏胶的自凝现象;免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。

  三、免疫散射比浊法

  (一)原理

  溶液中的微粒受到光线照射后,微粒对光线产生反射和折射而形成散射光。

  散射光强度与颗粒的分子量、数目、大小及入射光强度成正比,与微粒至检测器的距离、入射光波长成反比,因此使用高强度光源如激光、较短波长的入射光,可提高检测灵敏度。

  当颗粒直径小于入射光波长的1/10时,散射光强度在各个方向的分布均匀一致,称为Rayleigh散射;

  当颗粒直径大于入射光波长的1/10到接近入射光波长时,随着颗粒直径增大,向前散射光强于向后散射光,称为Debye散射;

  当颗粒直径等于或大于入射光波长时,向前散射光远远大于向后散射光,称为Mile散射。

  在免疫浊度测定中,可溶性抗原与相应抗体反应,生成的免疫复合物颗粒由小变大,而且免疫复合物颗粒的大小随抗原抗体的比例、浓度和分子大小而变化,相应地也会出现散射光强度随角度而变化的情况,因此,很难用固定的公式来计算散射光的强度,而是采取适当的角度测量散射光强度。

  (二)定时散射比浊法

  在保证抗体过量的情况下,加入待测抗原。在反应的第一阶段,溶液中产生的散射光信号波动较大,所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。

  1.反应阶段加入全量标本,在4分钟内测量散射光信号。

  2.使所有未知抗原全部与抗体结合形成抗原-抗体复合物,故需要:抗体过量;对抗原过量进行阈值限定。

  (三)速率散射比浊法

  是抗原抗体结合反应的动力学测定法。速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成IC的量(不是免疫复合物累积的量)。每项检测仅1~2分钟即可完成。

  在某一时间抗原抗体反应速率最快,单位时间内免疫复合物形成的量最多,散射光强度变化最大,即为所谓的速率峰。

  四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用

  (一)免疫比浊分析的影响因素

  1.抗原抗体比例

  2.抗体的质量:R型抗体是免疫比浊法的理想试剂,而且要特异性和亲和力好,纯度和效价高。

  3.增浊剂的使用

  4.入射光光源和波长

  5.结果报告中的计量单位

  6.伪浊度:非抗原抗体特异性结合形成的浊度,称为伪浊度,可导致抗原检测结果假性升高。伪浊度形成的原因包括:①混浊标本、高血脂标本、反复冻融标本;②抗体效价低(<1:20)、抗血清灭活处理、抗血清含有交叉反应性抗体等;③增浊剂PEG浓度过高;④抗血清细菌污染和变质;⑤器材尤其是比色杯不清洁、尘埃污染等;⑥缓冲液的离子强度太高,pH和温度不适合等。

  7.标准曲线制备与质量控制:应用仪器规定的标准品制备剂量-反应曲线,一般采用5点或6点定标。每更换一批试剂,应重新制备剂量-反应曲线。为保证结果准确可靠,选取合适的质控血清。

  (二)临床应用

  主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列,如IgG、IgA、IgM;免疫球蛋白亚类;补体C3、C4;血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。

  第二节 自动化发光免疫分析系统

  自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。

  一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪

  该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术,以吖啶酯为化学发光剂,以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。

  二、酶联发光免疫分析仪

  (一)辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪:以HRP标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体,鲁米诺为化学发光剂,还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。

  (二)碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪:以ALP标记抗原或抗体,以顺磁性微粒子为固相载体,用AMPPD作为化学发光剂。这种化学发光剂发光稳定,持续时间可达几十分钟,容易测定,容易控制。

  (三)碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪: 以ALP标记抗原或抗体,以塑料微粒为固相载体,以4-甲基伞型酮磷酸盐(4-MUP)作为酶促反应的荧光基质(底物)。

  三、电化学发光免疫分析仪(ECLIA)

  以顺磁性微粒为固相载体,用三联吡啶钌标记抗原或抗体,三丙胺(TPA)为电子供体。

  电化学发光稳定、持续时间长,易于控制。

  四、在临床免疫检测中的应用

  自动发光免疫分析系统智能化程度高,敏感度高、特异性强、精密度和准确性均可高于RIA,特别是检测灵活性高,快速,检测试剂稳定并易于进行质量控制。

  可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。

  第三节 自动化荧光免疫分析系统

  一、时间分辨荧光免疫分析仪

  (一)原理

  属于非均相荧光免疫测定,镧系元素属于三价稀土离子,包括铕(Eu3+),钐(Sm3+),铽(Tb3+),钕(Nd3+)和镝(Dys+)等,它们的荧光寿命较长,尤其是Eu3+和Tb3+的荧光寿命特别长且荧光强。因此,时间分辨荧光免疫测定中多用Eu3+和Tb3+为标志物。以镧系元素(尤其是铕(Eu3+))标记抗原或抗体作为示踪物,它的激发光谱带较宽,发射光谱带窄,来自生物样品的荧光干扰少。激发光谱和发射光谱之间的位移大,能有效地分开激发光和发射的荧光。

  (二)分析物解离增强原理

  被镧系元素标记的抗体或抗原形成IC在弱碱性反应液中经激发后的荧光信号较弱,必须再加入增强液,使IC的pH降低至2~3,以利于Eu3+从复合物上解离,游离的Eu3+与另一种螯合剂结合,形成高强度荧光的稳定螯合物,又将该技术称为解离增强镧系元素荧光免疫(DELFIA),这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。

  (三)注意事项

  1.TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染,使本底升高,所用试剂和器材应尽量防尘。

  2.载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板,其荧光本底低。

  二、荧光偏振免疫分析仪

  荧光偏振免疫测定(FPIA)为一种均相荧光免疫测定方法,荧光强度与荧光标志物质在溶液中旋转的速度与分子大小成反比,分子大,转动速度慢,荧光强度大;分子小,转动速度快,荧光强度小。常采用抗原抗体竞争反应原理,适用于小分子半抗原(如药物浓度)的检测。

  第四节 自动化酶联免疫分析系统

  ELISA能够测定传染病标志物、肿瘤标志物、骨代谢标志物和内分泌激素等许多项目。

  全自动酶联免疫分析仪中的连体机工作速度快,自动化程度高,适合大批量样本的处理,如血站系统。

  分体机,加样速度快,适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。

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