第二十章　免疫检验自动化仪器分析

　　第一节　自动化免疫浊度分析系统

　　免疫浊度分析属液相沉淀试验，其基本原理是抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(<19S)，在增浊剂(如PEG、NaF等)的作用下，迅速形成免疫复合物微粒(>19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。

　　一、免疫透射比浊法

　　(一)原理

　　可溶性抗原抗体反应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，吸光度(A值)与免疫复合物量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品相比较，可确定标本中抗原的含量。

　　仪器工作过程

　　1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。

　　2.将待测标本和标准抗原溶液(5个浓度抗原标准品)与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。

　　3.按方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。

　　(二)方法评价

　　1.优点：灵敏度比单扩法高，操作简便，结果准确，且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测。

　　2.不足：①抗体用量较大;②溶液中IC分子若过小则阻挡不了光线的通过;若数量太少则对光通量影响不大;灵敏度较散射比浊法低;③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段，检测需在抗原-抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。

　　二、免疫胶乳比浊法

　　(一)原理

　　用抗体致敏胶乳颗粒，在遇到相应抗原时，形成IC，引起胶乳颗粒凝聚。抗原-抗体反应后溶液的吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关。采用透射比浊法或散射比浊法测定。

　　(二)方法评价

　　本法敏感度高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化;

　　血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶的自凝现象;免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。

　　三、免疫散射比浊法

　　(一)原理

　　溶液中的微粒受到光线照射后，微粒对光线产生反射和折射而形成散射光。

　　散射光强度与颗粒的分子量、数目、大小及入射光强度成正比，与微粒至检测器的距离、入射光波长成反比，因此使用高强度光源如激光、较短波长的入射光，可提高检测灵敏度。

　　当颗粒直径小于入射光波长的1/10时，散射光强度在各个方向的分布均匀一致，称为Rayleigh散射;

　　当颗粒直径大于入射光波长的1/10到接近入射光波长时，随着颗粒直径增大，向前散射光强于向后散射光，称为Debye散射;

　　当颗粒直径等于或大于入射光波长时，向前散射光远远大于向后散射光，称为Mile散射。

　　在免疫浊度测定中，可溶性抗原与相应抗体反应，生成的免疫复合物颗粒由小变大，而且免疫复合物颗粒的大小随抗原抗体的比例、浓度和分子大小而变化，相应地也会出现散射光强度随角度而变化的情况，因此，很难用固定的公式来计算散射光的强度，而是采取适当的角度测量散射光强度。

　　(二)定时散射比浊法

　　在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原。在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。

　　1.反应阶段加入全量标本，在4分钟内测量散射光信号。

　　2.使所有未知抗原全部与抗体结合形成抗原-抗体复合物，故需要：抗体过量;对抗原过量进行阈值限定。

　　(三)速率散射比浊法

　　是抗原抗体结合反应的动力学测定法。速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成IC的量(不是免疫复合物累积的量)。每项检测仅1～2分钟即可完成。

　　在某一时间抗原抗体反应速率最快，单位时间内免疫复合物形成的量最多，散射光强度变化最大，即为所谓的速率峰。

　　四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用

　　(一)免疫比浊分析的影响因素

　　1.抗原抗体比例

　　2.抗体的质量：R型抗体是免疫比浊法的理想试剂，而且要特异性和亲和力好，纯度和效价高。

　　3.增浊剂的使用

　　4.入射光光源和波长

　　5.结果报告中的计量单位

　　6.伪浊度：非抗原抗体特异性结合形成的浊度，称为伪浊度，可导致抗原检测结果假性升高。伪浊度形成的原因包括：①混浊标本、高血脂标本、反复冻融标本;②抗体效价低(<1:20)、抗血清灭活处理、抗血清含有交叉反应性抗体等;③增浊剂PEG浓度过高;④抗血清细菌污染和变质;⑤器材尤其是比色杯不清洁、尘埃污染等;⑥缓冲液的离子强度太高，pH和温度不适合等。

　　7.标准曲线制备与质量控制：应用仪器规定的标准品制备剂量-反应曲线，一般采用5点或6点定标。每更换一批试剂，应重新制备剂量-反应曲线。为保证结果准确可靠，选取合适的质控血清。

　　(二)临床应用

　　主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如IgG、IgA、IgM;免疫球蛋白亚类;补体C3、C4;血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。

　　第二节　自动化发光免疫分析系统

　　自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。

　　一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪

　　该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。

　　二、酶联发光免疫分析仪

　　(一)辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪：以HRP标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。

　　(二)碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪：以ALP标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂。这种化学发光剂发光稳定，持续时间可达几十分钟，容易测定，容易控制。

　　(三)碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪： 以ALP标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体，以4-甲基伞型酮磷酸盐(4-MUP)作为酶促反应的荧光基质(底物)。

　　三、电化学发光免疫分析仪(ECLIA)

　　以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体。

　　电化学发光稳定、持续时间长，易于控制。

　　四、在临床免疫检测中的应用

　　自动发光免疫分析系统智能化程度高，敏感度高、特异性强、精密度和准确性均可高于RIA，特别是检测灵活性高，快速，检测试剂稳定并易于进行质量控制。

　　可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。

　　第三节　自动化荧光免疫分析系统

　　一、时间分辨荧光免疫分析仪

　　(一)原理

　　属于非均相荧光免疫测定，镧系元素属于三价稀土离子，包括铕(Eu3+)，钐(Sm3+)，铽(Tb3+)，钕(Nd3+)和镝(Dys+)等，它们的荧光寿命较长，尤其是Eu3+和Tb3+的荧光寿命特别长且荧光强。因此，时间分辨荧光免疫测定中多用Eu3+和Tb3+为标志物。以镧系元素(尤其是铕(Eu3+))标记抗原或抗体作为示踪物，它的激发光谱带较宽，发射光谱带窄，来自生物样品的荧光干扰少。激发光谱和发射光谱之间的位移大，能有效地分开激发光和发射的荧光。

　　(二)分析物解离增强原理

　　被镧系元素标记的抗体或抗原形成IC在弱碱性反应液中经激发后的荧光信号较弱，必须再加入增强液，使IC的pH降低至2～3，以利于Eu3+从复合物上解离，游离的Eu3+与另一种螯合剂结合，形成高强度荧光的稳定螯合物，又将该技术称为解离增强镧系元素荧光免疫(DELFIA)，这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。

　　(三)注意事项

　　1.TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防尘。

　　2.载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低。

　　二、荧光偏振免疫分析仪

　　荧光偏振免疫测定(FPIA)为一种均相荧光免疫测定方法，荧光强度与荧光标志物质在溶液中旋转的速度与分子大小成反比，分子大，转动速度慢，荧光强度大;分子小，转动速度快,荧光强度小。常采用抗原抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原(如药物浓度)的检测。

　　第四节　自动化酶联免疫分析系统

　　ELISA能够测定传染病标志物、肿瘤标志物、骨代谢标志物和内分泌激素等许多项目。

　　全自动酶联免疫分析仪中的连体机工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理，如血站系统。

　　分体机，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。

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