第十七章　流式细胞仪分析技术及应用

　　第一节　概述

　　流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成

　　一、工作原理

　　采用激光作为激发光源 ，保证其具有更好的单色性与激发效率;利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性;用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。

　　标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，液柱与水平方向的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中因细胞大小和胞内颗粒多少的不同会被激发而产生不同的散射光

　　一台好的流式细胞仪每秒可测量15000个细胞，测定1000个荧光染料分子的粒子。

　　二、散射光的测定

　　(一)前向散射光　激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度(0.5°～10°)向前方散射讯号。FS信号的强弱与细胞的体积成正比，因此可以说FS是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。

　　(二)侧向散射光　激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号。SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性。

　　三、荧光测量

　　荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不相同。每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又产生特定波长荧光。通过一些波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光、荧光信号区分开。选择不同的单克隆抗体及荧光染料可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。

　　(一)荧光信号测量与放大器

　　线性放大器用于测量信号强度变化范围较小的信号或具有生物学线性过程的信号，如前向散射光的测量与CD3+细胞DNA指数的测量。

　　对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且其光谱信号较复杂的信号，在免疫测量中最常使用。

　　(二)荧光补偿

　　依靠滤光片是不能完全阻挡干扰信号，在每两种荧光的发射光信号中仍有不可避免的重叠现象。该重叠区越大，信号检测的准确性越差。 通常采用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的准确性。

　　四、细胞分选原理

　　(一)分选的基本原理

　　当细胞悬液形成液流柱流经流动室，由于振动形成液滴。被设定了分选参数的细胞的会被充电而带有电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场时，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。

　　1.分选速度：至少达5000个/秒左右。

　　2.分选纯度　与仪器的精密度直接相关，同时与被分选细胞与细胞悬液中其他细胞有无相互重叠的生物学特性密切相关。

　　3.分选收获率　是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低与被分选细胞和不选细胞间的生物学特性是否重叠有关。当被要求分选的细胞纯度高，收获率相对低。

　　4.分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。该得率与分选的速度密切相关，当分选速度过高，会使部分目的细胞漏检，使得率下降;分选速度降低，目的细胞信号被检时间增加，得率增加。

　　第二节　数据的显示与分析

　　一、参数

　　（一）前向散射光（FS）：反映颗粒的大小。

　　（二）侧向散射光（SS）：反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。

　　(三)荧光(FL)：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。

　　二、数据显示方式

　　(一)单参数直方图：一维资料中最多使用的图形，由一维参数(荧光或散射光)与颗粒计数构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少，用于定性、定量资料的分析。

　　(二)双参数散点图：

　　1.点图：由两维参数构成，利用颗粒密度反映同样荧光强度的颗粒数量的多少。

　　2.二维等高图：用等高线来表示细胞数量。越往里面的线上的点代表的细胞数越多，等高线越密集，细胞数变化越快。

　　3.假三维等高图：是计算机软件在二维等高图基础上作出的三维立体图，由于图中的一维不是参数，而是细胞数，因而称为假三维等高图。

　　(三)三参数散点图　三维坐标均为参数(散射光或荧光)而非细胞数。

　　(四)流式细胞仪的多参数分析　标记了多色荧光的细胞在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射光信号可以根据需要进行组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。

　　三、设门分析技术

　　门设置是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

　　第三节　流式细胞仪免疫分析的技术要求

　　一、免疫检测样品制备

　　(一)新鲜实体组织单细胞悬液的制备：最常用的方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法等方法。

　　(二)单细胞悬液的保存：最常用的处理方法有三种：深低温保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。

　　二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

　　在流式细胞免疫分析技术中，被测定的信号参数主要包括散射光信号和荧光信号两种，荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后，在激光束激发下产生的发射光。因此，荧光染料的选择和标记染色都是保证荧光信号产生非常关键的技术指标。

　　(一)免疫荧光标记最常用的荧光染料

　　用于免疫荧光染色的染料需具备以下几个条件：

　　荧光染料应有较高的量子产额和消光系数;

　　荧光染料对488nm的激发光波长有较强的吸收;

　　发射光波长与激发光波长之间应有较大的波长差;

　　容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。

　　1.异硫氰酸荧光素（FITC）：可产生亮绿色荧光。FITC是免疫荧光标记最常用的荧光探针。

　　2.德州红：与生物素偶联的抗体有很强的亲和力，产生红色荧光 。

　　3.藻胆蛋白类：主要包括藻红蛋白(PE)、藻青蛋白(PC)、别藻青蛋白(APC)三类。多发生橙色 至红色荧光。

　　4.能量传递复合染料

　　(二)免疫荧光标记

　　1.直接免疫荧光染色：特异性强，荧光标记干扰因素少

　　2.间接免疫荧光染色

　　3.双参数或多参数分析时荧光抗体的组合标记

　　(三)细胞自发荧光

　　三、免疫胶乳颗粒技术的应用

　　“液相芯片”技术是胶乳颗粒在流式细胞分析中的应用，流式微球阵列(CBA)技术属于其中的重要代表。

　　四、流式细胞免疫学技术的质量控制

　　(一)单细胞悬液制备的质量控制

　　1.采用适当的制备方式。

　　2.用溶血剂处理红细胞。

　　3.实体组织来源标本在制备单细胞悬液过程中，最好采用机械法。

　　4.温度与pH。

　　(二)细胞悬液免疫荧光染色的质量控制

　　1.温度对荧光染色的影响。

　　2.pH对荧光发射强度的影响。

　　3.荧光染料浓度的控制。

　　固定剂对免疫荧光染色的影响。

　　第四节　流式细胞术在免疫学检查中的应用

　　一、淋巴细胞及其亚群的分析

　　(一)淋巴细胞及亚群的分析

　　外周成熟的T细胞特有的标志TCR和CD3是重要的表面抗原，再按CD分子表达不同将T细胞分为CD4+和CD8+两大亚群，又称为辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)。采用三色标记单克隆荧光抗体，用FCM检测，可对T细胞及亚群作出精确分类。

　　(二)B淋巴细胞及其亚群的分析

　　外周血中成熟的B细胞特有的重要标志为BCR，即膜表面免疫球蛋白（Smlg）。 成熟的B细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测CD5分子，可进一步将外周成熟的休止B细胞分为B1细胞和B2细胞。

　　(三)NK细胞分析

　　正常人外周血中成熟的NK细胞约10%左右，目前临床上常用三色荧光抗体标记将CD3 ^- CD16 ⁺ CD56 ⁺ 淋巴细胞确定为NK细胞。

　　二、淋巴细胞功能分析

　　需采用细胞内细胞因子测定或体外培养后细胞的标记染色进行淋巴细胞检测，如：

　　1.细胞介导细胞毒性试验

　　2.细胞内细胞因子测定

　　三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型

　　FCM在淋巴瘤及血液病的发病机制、诊断、治疗和预后判断方面都具有重要的价值。

　　四、肿瘤耐药相关蛋白分析

　　五、AIDS病检测中的应用

　　艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体后，选择性侵入人类T淋巴细胞亚群中的CD4+T辅助细胞，使Th细胞群体受到破坏，T细胞亚群比例失衡，T淋巴细胞功能降低，进一步导致全身免疫功能受损，全身免疫状态下降。

　　AIDS患者的一个特征性免疫诊断指标表现为：T淋巴细胞总数减少，T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc＜1.0 ，Th细胞数量显著下降甚至测不出，而Tc细胞数量可正常或增加，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。

　　HIV携带者，病毒未复制时，其Th细胞下降不明显 ;HIV阳性而无症状的患者，Tc对Tc激活剂不反应者，其体内CD4+Th细胞水平下降迅速，条件致病微生物的感染率也同时增加，对Tc激活剂反应敏感者，可维持CD4+Th细胞水平降低较慢或不降低，减少发生AIDS的几率。当发展为AIDS时，Th细胞水平明显下降，如Th1细胞

　　六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析

　　在某些自身免疫性疾病中，HLA抗原的检出率较正常人群中所检出者为高。最典型的疾病是强直性脊柱炎，其外周的HLA-B27的表达及表达程度与疾病的发生有很高的相关性。

　　七、移植免疫中的应用

　　移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型(FCXM)和群体反应性抗体(PRA)检测。

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