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2020临床医学检验技士考试《免疫检验》第十一章:化学发光免疫分析技术

来源 :中华考试网 2019-09-04

第十一章 生物素-亲和素放大技术

  第一节 生物素的理化性质与标记

  一、活化生物素

  利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物,称为活化生物素。

  (一)标记蛋白质氨基的活化生物素

  将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和,生成BLAHS。BLAHS中的-C=0基团与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键,从而标记上生物素。

  (二)标记蛋白质醛基的活化生物素有两种:生物素酰肼(BHZ,用于偏酸性糖蛋白的生物素标记)和肼化生物胞素(BGHZ)。

  (三)标记蛋白质巯基的活化生物素:3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

  (四)标记核酸的活化生物素:生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连,构成生物素标记的核酸探针。

  1.光敏生物素:用于DNA或RNA的标记。

  2.生物素脱氧核苷三磷酸:将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链DNA中。

  3.BNHS和BHZ:与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联,使核酸分子生物素化。

  二、生物素标记蛋白质

  (一)生物素化蛋白质衍生物的特性

  生物素通过羧基与多种大分子偶联活化。一个蛋白质分子可连接多个生物素分子,在与亲和素的反应中成为多价。

  生物素化蛋白质衍生物有两类,一种是生物素化的大分子活性物质(如抗原、抗体),另一种是标记材料(如酶)结合生物素后制成的标记物。

  (二)标记方法

  1.标记抗体、抗原:由于一个抗体分子可连接多个生物素分子,因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记,制备的标记物具有通用性。

  2.标记酶:如生物素标记辣根过氧化物酶(HRP)。

  (三)标记注意事项

  1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的理化性质(酸性、中性或碱性),选择相应的活化生物素和反应条件。

  2.标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例,使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围,以免影响标记物的活性。

  3.为减少生物素标记蛋白质后,大分子物质造成的空间位阻影响,有利于生物素与亲和素的结合,可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。

  4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同。

  第二节 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

  亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白,几乎可以和任何用于标记的物质结合。

  一、亲和素及其活性

  亲和素(AV)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用,尤其是与生物素结合后,稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素,二者之间的亲和力极强。

  二、链霉亲和素及其活性

  链霉亲和素(SA)分子中每条肽链都能结合一个生物素,因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。

  三、亲和素(或链霉亲和素)的标记

  用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125I、胶体金、荧光素和化学发光物,大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等,其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素(FITC)和胶体金。

  亲和素或链霉亲和素与酶的标记结合物的制备可用普通酶直接标记,还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合,间接地与酶形成结合物。

  第三节 生物素-亲和素系统的特点

  一、灵敏度:每个亲和素分子有四个生物素结合部位,因此BAS具有多级放大作用,提高检测灵敏度。

  二、特异性:亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力,其反应呈高度专一性。而且,BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响,使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

  三、稳定性:亲和素与生物素间的亲和常数极高,结合形成的复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性;而且酸、碱、变性剂等均不影响其结合。

  四、适用性:生物素和亲和素可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合,用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系;而且也可制成亲和介质,用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。

  第四节 生物素-亲和素系统的应用

  一、生物素-亲和素系统基本类型及原理

  (一)BAB法:也称为桥联亲和素-标记生物素法(BRAB),是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂,将检测反应体系中抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)连接起来。

  (二)ABC法:预先将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合,形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物(ABC或SABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体(直接法)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时,ABC(或SABC)中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合,使抗原-抗体反应体系与ABC(或SABC)标记体系连成一体进行检测。

  (三)BA法:BA(或LAB)法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。

  二、生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用

  (一)将BAS与ELISA偶联可提高ELISA的灵敏度:每个亲和素可结合4个生物素,可使反应明显放大;亲和素与生物素间极高的亲和力,使反应结合更牢固稳定,而且特异性高;用小分子生物素代替酶标记抗体,可减少反应中的空间位阻。

  (二)生物素-亲和素系统可作为均相酶免疫测定中高效的酶活性调变系统。

  三、生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用

  通常采用BA法,即用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素);也可采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥,两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素(BAB法)或荧光标记的抗亲和素(或链霉亲和素)抗体的夹心法。

  四、生物素-亲和素系统在放射免疫测定中的应用

  BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联,用于对终反应的放大(BA法)。

  此外,BAS也可用于IRMA反应后B,F成分的分离。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦,待测复合物与固相结合更牢固,操作更简便。

  五、生物素-亲和素系统在分子生物学中的应用

  BAS在分子生物学领域中的应用主要集中在:

  1.以生物素标记核酸探针进行的定位检测

  2.用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化

  3.将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR用于抗原的检测

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