第十一章　生物素-亲和素放大技术

　　第一节　生物素的理化性质与标记

　　一、活化生物素

　　利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

　　(一)标记蛋白质氨基的活化生物素

　　将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成BLAHS。BLAHS中的-C=0基团与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而标记上生物素。

　　(二)标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼(BHZ，用于偏酸性糖蛋白的生物素标记)和肼化生物胞素(BGHZ)。

　　(三)标记蛋白质巯基的活化生物素：3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

　　(四)标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

　　1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。

　　2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链DNA中。

　　3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。

　　二、生物素标记蛋白质

　　(一)生物素化蛋白质衍生物的特性

　　生物素通过羧基与多种大分子偶联活化。一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，在与亲和素的反应中成为多价。

　　生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质(如抗原、抗体)，另一种是标记材料(如酶)结合生物素后制成的标记物。

　　(二)标记方法

　　1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。

　　2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶(HRP)。

　　(三)标记注意事项

　　1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的理化性质(酸性、中性或碱性)，选择相应的活化生物素和反应条件。

　　2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。

　　3.为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。

　　4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同。

　　第二节　亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

　　亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。

　　一、亲和素及其活性

　　亲和素(AV)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强。

　　二、链霉亲和素及其活性

　　链霉亲和素(SA)分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。

　　三、亲和素(或链霉亲和素)的标记

　　用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125I、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素(FITC)和胶体金。

　　亲和素或链霉亲和素与酶的标记结合物的制备可用普通酶直接标记，还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。

　　第三节　生物素-亲和素系统的特点

　　一、灵敏度：每个亲和素分子有四个生物素结合部位，因此BAS具有多级放大作用，提高检测灵敏度。

　　二、特异性：亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

　　三、稳定性：亲和素与生物素间的亲和常数极高，结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性;而且酸、碱、变性剂等均不影响其结合。

　　四、适用性：生物素和亲和素可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系;而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。

　　第四节　生物素-亲和素系统的应用

　　一、生物素-亲和素系统基本类型及原理

　　(一)BAB法：也称为桥联亲和素-标记生物素法(BRAB)，是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂，将检测反应体系中抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)连接起来。

　　(二)ABC法：预先将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物(ABC或SABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体(直接法)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时，ABC(或SABC)中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC(或SABC)标记体系连成一体进行检测。

　　(三)BA法：BA(或LAB)法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。

　　二、生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用

　　(一)将BAS与ELISA偶联可提高ELISA的灵敏度：每个亲和素可结合4个生物素，可使反应明显放大;亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高;用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。

　　(二)生物素-亲和素系统可作为均相酶免疫测定中高效的酶活性调变系统。

　　三、生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用

　　通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素);也可采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素(BAB法)或荧光标记的抗亲和素(或链霉亲和素)抗体的夹心法。

　　四、生物素-亲和素系统在放射免疫测定中的应用

　　BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大(BA法)。

　　此外，BAS也可用于IRMA反应后B，F成分的分离。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦，待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。

　　五、生物素-亲和素系统在分子生物学中的应用

　　BAS在分子生物学领域中的应用主要集中在：

　　1.以生物素标记核酸探针进行的定位检测

　　2.用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化

　　3.将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR用于抗原的检测

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