第八章　荧光免疫技术

　　第一节　概述

　　荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。

　　一、荧光的基本知识

　　1.荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。

　　2.发射光谱：固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。

　　3.激发光谱：固定检测发射光荧光波长，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光发射强度谱图。

　　4.荧光效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。

　　5.荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。

　　6.荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素(如紫外线照射、高温、苯胺、酚、I-、硝基苯等)作用下，发射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。

　　7.荧光偏振。

　　二、荧光物质

　　(一)荧光色素

　　1.异硫氰酸荧光素(FITC)：呈现明亮的黄绿色荧光。

　　2.四乙基罗丹明(RB200)：呈橘红色荧光。

　　3.四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：呈橙红色荧光。

　　4.藻红蛋白(R-RE)：呈明亮的橙色荧光。

　　(二)其他荧光物质

　　1.镧系螯合物：其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。

　　2.酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷本身无荧光，受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是4-甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是对羟基苯乙酸等。

　　第二节　荧光抗体技术

　　一、荧光抗体的制备

　　(一)抗体要求

　　将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。

　　(二)荧光素要求　异硫氰酸荧光素最常用

　　要求：

　　①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除;

　　②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率;

　　③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明;

　　④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质;

　　⑤标记方法简单、安全无毒;

　　⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

　　(三)抗体的荧光素标记

　　1.搅拌法：适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但易引起较强的非特异性荧光染色。

　　2.透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。

　　(四)荧光素标记抗体的纯化

　　抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素。

　　纯化方法可采用透析法或层析分离法。

　　(五)荧光抗体的鉴定

　　1.荧光素与蛋白质的结合比率　荧光素与蛋白的过量结合是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。

　　荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(F/P)。比值越大，则抗体结合的荧光素越多，反之则结合越少。一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P=1.5为宜，用于活细胞染色F/P=2.4为宜。

　　2.抗体效价　可以采用双向免疫扩散试验测定，抗原含量为1g/L时，抗体效价>1:16者较为理想。

　　3.抗体特异性①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光;②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，荧光强度应受到明显抑制。

　　(六)荧光抗体的保存

　　防止抗体失活和防止荧光淬灭。

　　小量分装，-20℃冻存可保存2～3年。

　　真空干燥后可长期保存。

　　稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。

　　二、标本的制作

　　组织材料可制备成石蜡切片(较少用)或冷冻切片。切片要求尽量薄些，以利于抗原抗体接触和镜检。

　　组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。

　　细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。

　　过程中应保持抗原的完整性，并在操作中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。

　　三、荧光抗体染色与结果判断

　　荧光抗体与抗原反应，一般在25～37℃，30分钟，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。

　　(一)直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少;缺点是敏感度偏低，需制备特异性的荧光抗体。

　　(二)间接法：可用于检测抗原和抗体，普通一抗+荧光二抗。灵敏度高，仅需一种荧光抗体。

　　(三)双标记法：FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本做荧光染色。

　　(四)荧光抗体染色结果判断：在每次实验时均需设立实验对照(阳性和阴性对照)。阳性细胞的显色分布有胞质型、胞核型和膜表面型三种类型。临床上根据特异性荧光强度达“+”(为荧光较弱但清楚可见)以上判定为阳性。

　　四、荧光显微镜的基本结构(了解)

　　(一)光源　通常用高压汞灯、氙灯或卤素灯作为激发光源。

　　(二)滤光片　滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。

　　观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9。

　　(三)光路　分为透射光和落射光两种形式。

　　(四)聚光器　聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。

　　(五)镜头　目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。

　　第三节　荧光免疫分析的类型

　　用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。

　　一、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)

　　用镧系元素标记抗原或抗体，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。

　　(一)基本原理

　　1.时间分辨

　　正常组织在激发光照射下可以发出一定波长的荧光，但该荧光寿命较短(1～10ns)，而镧系元素螯合物的荧光寿命较长(10～1000μs)。故待短寿命背景荧光完全衰变后再测定镧系元素离子螯合物的特异性荧光信号。

　　2.Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长差，如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。镧系元素位移大。

　　3.发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±1Onm。利用滤光片只允许此波段的荧光通过，避免干扰。

　　4.荧光标记物的相对比活性：比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。

　　5.信号增强

　　Eu3+标记抗原抗体复合物在弱碱性溶液中被激发后的荧光信号较弱，加入一种酸性增强液可使Eu3+从复合物上完全解离下来，并与另一种螯合剂所螯合，以增强荧光信号。

　　(二)标记物和标记方法

　　1.标记物：多用Eu3+和Tb3+为标记物，其中Eu3+最为常用。

　　2.标记方法：镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合。

　　(三)方法类型

　　1.双抗夹心法：待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，在酸性环境下，复合物上的Eu3+解离下来，在340nm激发光照射下，形成荧光。

　　2.固相抗体竞争法：待检抗原和Eu3+标记的抗原与固相抗体竞争结合，荧光强度与待检抗原成反比。

　　3.固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争Eu3+标记抗体，荧光强度与待检抗原含量成反比。

　　(四)方法评价

　　1.优点：

　　灵敏度高;分析范围宽;标记结合物稳定，有效使用期长;测量快速，易自动化;无放射性污染。

　　2.缺点：

　　易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使本底增高。

　　二、荧光偏振免疫测定

　　利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。

　　(一)基本原理

　　荧光偏振免疫测定常用异硫氰酸荧光素(FITC)标记小分子抗原。

　　(二)方法评价

　　荧光偏振免疫测定样品用量少;荧光素标记结合物稳定，使用寿命长;方法重复性好;快速，易自动化;试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质;灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。

　　三、荧光酶免疫测定

　　利用酶标抗体(抗原)与待检抗原(抗体)反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。

　　(一)基本原理：以碱性磷酸酶(ALP)标记抗体(或抗原)，以固相载体包被抗原(或抗体)，碱性磷酸酶分解荧光底物4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)形成4-MU，经360nm激发光的照射，发出450nm的荧光。

　　(二)方法类型

　　1.双抗体夹心法：固相抗体和碱性磷酸酶标记抗体与待检抗原反应，加入底物4-MUP，荧光强度与待检抗原含量成正比。

　　2.双抗原夹心法：用固相抗原和酶标记抗原与待检抗体反应，加入底物进行酶促发光，荧光强度与待检抗体含量成正比。

　　3.固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。

　　(三)方法评价

　　固相荧光酶免疫测定法，避免了血清和其他生物样品的背景荧光会干扰。

　　第四节　荧光免疫技术在医学检验中的应用

　　一、荧光抗体技术的应用

　　1.自身抗体检测　辅助诊断自身免疫性疾病。

　　2.病原体检测　可快速鉴定病原体并可检测血清中抗体。

　　3.免疫病理检测　可用于组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测及肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定。

　　4.细胞表面抗原和受体检测

　　5.流式细胞分析将游离细胞作荧光抗体染色后，经单色激光照射后发出的荧光信号由荧光检测计检测。

　　二、荧光免疫测定的应用

　　1.时间分辨荧光免疫测定：用于蛋白质、激素(肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等)、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等测定。

　　2.荧光偏振免疫测定：适用于血清或尿液中小分子物质的测定，如药物、维生素、激素。

　　3.荧光酶免疫测定：可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子等。

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