第七章　放射免疫分析

　　第一节　放射免疫技术

　　一、基本类型及原理

　　(一)放射免疫分析(RIA)以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。

　　(二)免疫放射分析(IRMA)用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。

　　二、常用的放射性核素

　　125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。

　　三、放射性标记物制备及鉴定

　　(一)原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。

　　(二)标记及类型

　　1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。常用的方法为：①氯胺 T(ch-T)法;②乳过氧化物酶标记法。

　　2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。

　　(三)放射标记物的纯化

　　1.凝胶过滤法：分子筛机制。

　　2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。

　　3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。

　　4.高效液相色谱法。

　　(四)放射标记的鉴定

　　1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求>95%。该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。

　　2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。

　　3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。

　　四、方法学评价

　　除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：

　　(一)可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。平行性好者可靠。

　　(二)剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。

　　(三)高剂量钩状效应：标本中被测物浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。可以通过选用髙亲和力抗体或对此类标本进行稀释后测定以改善或消除。

　　第二节　放射免疫分析

　　放射免疫分析(RIA)是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，特别适用于激素、多肽等的超微量分析。

　　一、基本原理

　　经典RIA是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。

　　二、实验方法及测定

　　(一)抗原抗体反应：将未标记抗原(标准品和待测样品)、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中，在一定条件(温度、时间及介质pH)下进行竞争抑制反应。

　　先加待测样品(或标准品)和抗血清，使非标记抗原与抗体达到结合平衡，然后再加入标记抗原竞争与抗体结合。

　　(二)分离结合与游离标记物：RIA反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物(B)。由于其含量极少，不能自行沉淀，需加入适当的沉淀剂将其彻底沉淀，然后经离心使其与游离的标记抗原(F)分离。某些小分子抗原，也可采用吸附法分离B与F。

　　理想的分离方法应分离彻底、迅速;分离试剂和过程不影响反应平衡，而且效果不受反应介质因素的影响;操作应简单、重复性好以及经济。方法：

　　1.第二抗体沉淀法：反应完成后加入二抗形成复合沉淀。为增强效果可加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，或是将二抗与某些颗粒固相物连接。

　　2.聚乙二醇(PEG)沉淀法：能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质，而不沉淀小分子抗原。当温度髙于30℃时，沉淀物易复溶。

　　3.PR试剂法 先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。

　　4.活性炭吸附法：活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白(如抗体和免疫复合物)则留在溶液中。

　　(三)放射性测量及数据处理

　　分离B、F后，可分别对二者进行测定。

　　绘制标准曲线(剂量-反应曲线)，样品管以其测量或计算的反应参数，通过标准曲线即可查出相应的待检抗原浓度。

　　第三节　免疫放射分析

　　免疫放射分析(IRMA)是以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应，用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。

　　一、基本原理

　　1.单位点IRMA：利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，反应平衡后，再用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。

　　2.双位点IRMA：先用固相抗体与抗原反应结合，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相的抗原的另一抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。

　　两种IRMA最后测得的放射性均与样品中待测抗原的含量呈正相关。

　　二、IRMA与RIA的比较

　　第四节　放射免疫分析技术的应用

　　常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。

　　但具有放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，试剂盒有效期不长，无法自动化分析等诸多不足。

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