第六章　沉淀反应

　　沉淀反应是指可溶性抗原 与相应抗体 在特定条件下发生特异性结合 时出现的沉淀现象。

　　第一节　沉淀反应的特点

　　沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。

　　沉淀反应分两个 阶段，

　　第一阶段为抗原抗体发生特异性结合 ，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见 ;

　　第二阶段为形成可见 的免疫复合物 ，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

　　第二节　液体内沉淀试验

　　一、絮状沉淀试验

　　抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响 ，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：

　　(一)抗原稀释法 抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。

　　(二)抗体稀释法 抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。

　　(三)方阵滴定法 即棋盘滴定法。

　　二、免疫浊度测定

　　属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量 抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。

　　(一)免疫比浊测定的影响因素

　　1.抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素。

　　当抗原过量 时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应 。当抗体过量 时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论 。

　　在反应体系中需保持抗体适当过量 ，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。

　　2.抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求

　　（1）特异性强

　　（2）效价高： 低效价（＜1:20） 抗体会增加非特异性浊度(伪浊度)的产生。

　　（3）亲和力强： 则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。

　　（4）R型和H型抗体：

　　R型抗体 是指以家兔 为代表的小型动物 被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强 ，抗原抗体结合后不易发生解离 。

　　H型抗体是指以马 为代表的大型动物 注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱 ，抗原抗体结合后极易解离 。

　　3.抗原抗体反应的溶液

　　反应液最适pH为6.5～8.5 。常使用磷酸盐缓冲液 作为免疫比浊法的反应液。

　　在一定范围内，离子强度大，IC形成越快 。

　　4.增浊剂

　　某些非离子型亲水剂 对促进IC的形成有显著的增强 作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20 ，其作用是消除蛋白质(抗原或抗体)分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。

　　(二)免疫比浊法方法分类

　　1.透射免疫比浊法 　通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化，来定量抗原抗体的复合物。

　　2.散射免疫比浊法 　通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度 来定量抗原抗体的复合物。

　　3.免疫胶乳比浊法　是以胶乳作为载体 对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。

　　第三节　凝胶内沉淀试验

　　利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环 。

　　凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等 。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，借此可用以识别不同待测物分子量的差别。

　　一、单向扩散试验

　　在琼脂内混入抗体 ，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。

　　（一）试管法 将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖 溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使其自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。

　　(二)平板法 是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖 凝胶内，制成平板，在上打孔，将抗原加入孔中，37℃ 行自由扩散，24～48小时 后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。有两种计算方法：

　　1.Mancini曲线　适用大分子抗原 和长时间扩散（＞48小时） 的结果，沉淀环直径的平方(d2)与抗原浓度(c)呈线性关系：c/d2=k。

　　2.Fahey曲线　适用于小分子抗原 和较短时间扩散 的结果处理，用半对数纸画线，浓度对数logc与扩散环直径(d)呈线性关系：logc/d=k(其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数)。

　　(三)影响因素

　　1.抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。

　　2.每次测定都必须作标准曲线。

　　3.每次测定时必须用质控血清作质控。

　　4.注意双环现象(出现了两种抗原性相同成分)。

　　二、双向扩散试验

　　让抗原 和抗体 在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成沉淀线，可对抗原或抗体进行定性 分析。

　　双向扩散试验灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量 。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。

　　(一)试管法 抗体——琼脂——抗原

　　(二)平板法 是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。

　　1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计

　　(1)沉淀线靠近抗原孔 ，则抗体 含量较大 ;

　　(2)沉淀线靠近抗体孔 ，则抗原 含量较大 ;

　　(3)不出现沉淀线 则无对应的抗体（抗原） 或者抗原过量 。

　　2.抗原或抗体相对分子量的分析

　　(1)分子量小者扩散快 ，反之则较慢。

　　(2)由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方 ;如果两者分子量大致相等，则形成直线。

　　3.抗原性质的分析

　　(1)两条沉淀线互相吻合相连 ，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同 ;

　　(2)沉淀线呈部分相切 ，说明两个抗原之间有部分相同 ;

　　(3)两条沉淀线交叉而过 ，说明两个抗原完全不同 。

　　4.抗体效价的滴定

　　固定抗原的浓度，稀释抗体;或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价 。

　　5.抗原或抗体纯度鉴定　用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线说明不纯 。

　　第四节　免疫电泳技术

　　电泳分析与沉淀反应的结合产物。

　　一、优点

　　(一)加快了沉淀反应的速度;

　　(二)电场规定了抗原抗体的扩散方向，使其集中，提高了灵敏度;

　　(三)可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。

　　二、对流免疫电泳 双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速 的免疫扩散技术。

　　在pH8.6 缓冲液中，大多蛋白质带强负电荷，在电场中向正极移动;而IgG等电点偏高(pH6～7)，在pH8.6时带负电荷较少 ，且分子量较大，移动速度慢。在凝胶的电渗 作用下，随水流向负极 。

　　IgG3和IgG4泳向正极，而IgG1和IgG2因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子挟裹向负极移动。

　　三、火箭免疫电泳

　　单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，实质上是加速的单向扩散试验。将抗体混入琼脂，样品孔中的抗原置于负极端，向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。

　　当琼脂中抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形 ，则表示未达终点 。作IgG定量时，因电渗呈纺锤状，可用甲醛与IgG上的氨基结合(甲酰化)IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度。

　　四、免疫电泳

　　区带电泳与免疫双扩散相结合的技术，为定性试验 。先用区带电泳 技术将抗原在凝胶中电泳，分成肉眼不可见的若干区带，电泳停止后，沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽 ，加入相应抗血清，置室温37℃作双向扩散，经18～24小时后 ，已分离成区带的各种抗原成分与抗体槽中相应抗体在两者比例适合处形成弧形沉淀线。

　　免疫电泳为定性 试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定 方面，例如多发性骨髓瘤 患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧。

　　五、免疫固定电泳

　　可用于各种蛋白质 的鉴定。原理：将待检样品在凝胶板上作区带电泳 ，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清 ，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。最后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。

　　本法可用于迁移率近似的蛋白和M蛋白的鉴定与分型，免疫球蛋白轻链，尿液中的本-周蛋白检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型，鉴定游离轻链，补体裂解产物等。

　　免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。

　　六、交叉免疫电泳

　　将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的技术。

　　可一次同时对多种抗原定量 。有利于各种蛋白组分的比较，对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。

　　第五节　沉淀反应在医学检验中的应用

　　免疫浊度法主要用于血液、体液中蛋白质的测定。稳定性好，敏感度高(达ng/L)，精确度高(CV<5%)，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测。

　　免疫固定电泳技术在临床应用较广。最大的优势是分辨力强，敏感度高，结果易于分析，现最常用于血清中M蛋白的鉴定与分型。

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