杂交瘤技术的基本原理

　　一、杂交瘤技术

　　(一)小鼠骨髓瘤细胞

　　1.细胞株稳定，易于传代培养。

　　2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。

　　3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷株。

　　4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。

　　(二)免疫脾细胞

　　选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，多用腹腔内或皮内多点注射法。如微量抗原，可脾脏内直接注射进行免疫。

　　(三)细胞融合

　　PEG(聚乙二醇)有助于细胞融合。

　　(四)杂交瘤细胞的选择性培养

　　将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。

　　1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。

　　2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中不能增殖。

　　3.杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞与脾细胞融合，获得HGPRT，可以利用次黄嘌呤合成DNA，故可以存活。

　　二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存

　　单个细胞培养又称克隆化。细胞克隆化一般至少进行3～5次。克隆化有以下几种方法：

　　(一)有限稀释法 操作简单，出现率高，为实验室最常用的方法。

　　(二)显微操作法 直观可靠，但操作时间过长，容易增加污染机会。

　　(三)荧光激活细胞分选仪 先进、高效、高纯度、昂贵。

　　(四)软琼脂平板法 本法缺点是琼脂融化温度较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，操作较复杂，克隆出现率不稳定。

　　杂交瘤细胞应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。目前均采用液氮保存细胞。(注意逐步降温、快速复温)

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