免疫原的制备

　　免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。

　　一、颗粒性抗原的制备

　　细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。

　　细胞抗原(如绵羊红细胞)一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。

　　细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。

　　颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。

　　二、可溶性抗原的制备和纯化

　　(一)组织和可溶性抗原的粗提

　　蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。

　　1.组织匀浆的制备

　　(1)高速组织捣碎机法;

　　(2)研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。

　　2.细胞的破碎

　　(1)反复冻融法：-20℃冷冻，30～37℃融化。

　　(2)超声破碎法

　　(3)自溶法

　　(4)酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。

　　(5)表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。

　　3.免疫球蛋白片段的制备

　　(1)非共价键解离法：改变pH环境或用变性剂。

　　(2)共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。

　　(3)溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。

　　(4)酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。

　　(二)可溶性抗原的提纯和纯化

　　1.超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。

　　2.选择性沉淀法：

　　(1)核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。

　　(2)盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。

　　(3)有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。

　　(4)聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇(PEG)。

　　3.凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。

　　4.离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。

　　5.亲和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。

　　6.电泳法：蛋白质在同一pH环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。

　　(三)纯化抗原的鉴定

　　1.蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度(A)值。

　　2.分子量测定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法、凝胶过滤法等。

　　3.纯度鉴定：采用醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。

　　4.免疫活性鉴定：双向免疫扩散法、ELISA法等。

　　三、半抗原性免疫原的制备

　　半抗原指只具有抗原性而无免疫原性的物质。 多见于分子量小于4000的有机物质。半抗原与载体相结合具有免疫原性。

　　(一)载体

　　1.蛋白质：以牛血白蛋白最常见。

　　2.多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。

　　3.大分子聚合物和某些颗粒。

　　(二)半抗原与载体的连接方法

　　1.物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原。

　　2.化学方法：通过功能基团将半抗原与载体连接。

　　(1)带有游离氨基或游离羧基的半抗原，脑啡肽、促胃液素、前列腺素等多肽激素，可直接与载体连接。

　　(2)无羧基和氨基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，需要用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物后才能与载体连接。

　　(三)半抗原性免疫原的鉴定

　　20个以上半抗原连接在一个载体分子上，才能有效刺激免疫动物产生抗体。 方法有：

　　1.吸收光谱分析法

　　2.放射性核素标记半抗原渗入法

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