第一节概述

流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。

一、工作原理

流式细胞仪的工作原理是采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率;利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性;用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。

(一)基本组成结构

1.液流系统

由样本和鞘液组成。

待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。

鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。

2.光学系统

(1)激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。

(2)分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。

(3)光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。

(4)透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。

(5)滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过;短通滤片，允许短于设定波长的光通过;带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。

(6)光电倍增管(PMT)：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲(数字数据)信号。

3.数据处理系统

主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。

(二)基本工作原理

检测需要标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，光电倍增管将已接收的光电信号转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上，包括了单参数和二维或三维图像资料，阳性细胞百分率、斜率、峰值、峰面积等多参数资料。

二、散射光的测定

(一)前向散射光

激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度(0.5°～10°)向前方散射讯号。在激光束正前方的检测器为前向散射光检测器，其收集的散射光信号又称为小角散射，对同一个细胞群体，FS信号的强弱与细胞的体积成正比，因此可以说FS是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。

(二)侧向散射光

激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号。与激光束垂直方向的检测器为侧向光检测器，也称为90°散射光检测器。其收集的散射光信号主要由细胞的致密性及粒度折射产生，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。

三、荧光测量

(一)荧光信号测量与放大器

荧光信号的放大测定通常使用线性放大器和对数放大器。

线性放大器用于测量信号强度变化范围较小的信号或具有生物学线性过程的信号，如前向散射光的测量与CD3+细胞DNA指数的测量。

对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且其光谱信号较复杂的信号，在免疫测量中最常使用。

最新的仪器中，传统的对数放大器已改为利用数字信号进行对数转换，使讯号保持高水平的线性度和重复性，为仪器与仪器之间的质量控制打下基础，保证资料来源的稳定性。

目前使用的流式细胞仪至少能用一个激光束检测3色甚至4色激发荧光信号。从而使仪器的检测特异性及精确性进一步提高。

(二)荧光补偿

在实际检测中，仅依靠滤光片是不能完全阻挡干扰信号的。在每两种荧光的发射光信号中仍有不可避免的重叠现象，该重叠区越大，信号检测的准确性越差，通常采用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的准确性。

四、细胞分选原理

(一)分选的基本原理

当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场时，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。

(二)分选的技术要求

1.分选速度 一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。

2.分选纯度　与仪器的精密度直接相关，同时与被分选细胞与细胞悬液中其他细胞有无相互重叠的生物学特性密切相关。

3.分选收获率　是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低同样与被分选细胞和不选细胞间的生物学特性是否重叠有一定关系。收获率与纯度之问有相对应关系。当被要求分选的细胞纯度高，收获率相对低，当被要求分选的细胞收获率高，其纯度就相对降低。

4.分选得率　是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。该得率与分选的速度密切相关，当分选速度过高，细胞信号通过检测时，会使部分目的细胞漏检，使得率下降;分选速度降低，目的细胞信号被检时间增加，得率增加。