第一节免疫细胞的分离

一、外周血单个核细胞的分离

外周血中单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间，因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。

分离介质是分离各类细胞的关键，对分离介质的基本要求是：①对细胞无毒;②基本等渗;③不溶于血浆及分离物质;④有特定的比重。

将2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，其比重为1.077±0.002，可作为常规的淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液。

主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

二、淋巴细胞的分离

纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。

1.黏附贴壁法

2.吸附柱过滤法

3.磁铁吸引法

4.Percoll分离液法

三、T细胞和B细胞的分离

1.E花环沉降法

2.尼龙毛柱分离法

四、T细胞亚群的分离

1.亲和板结合分离法

2.磁性微球分离法

3.荧光激活细胞分离仪分离法

五、不同细胞分离方法的综合评价

传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效果差。近期发展起来的细胞分离技术大多是基于利用细胞表面标志(抗原或受体)进行细胞分离，较早出现的技术以细胞亲和层析为代表。随后出现细胞固相包被技术，细胞淘洗技术，同时还有流式细胞仪分离技术，磁性微球分离法。

六、分离细胞的保存和活力测定

1.短期保存技术

将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。

2.长期保存技术

液氮深低温(-196℃)环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。

活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。

这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。