第三节酶免疫组织化学技术

酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。

一、组织处理

(一)标本的类型

1.涂片和印片

2.组织切片

3.细胞培养标本

与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。

酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。

二、酶标记抗体免疫组化染色

借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，通过酶对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，沉淀在靶抗原位置，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。

(一)直接法

将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，制备的抗体种类有限。

(二)间接法

将酶标记在第二抗体上 ，先将第一抗体(特异性抗体)与相应的组织抗原结合 ，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体(酶标记的抗体)与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。间接法的优点是检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。

三、非标记抗体免疫酶组化染色

(一)酶桥法

抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体(第二抗体)，将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。

(二)PAP法

PAP法是在酶桥法基础上的改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体(抗酶抗体)与酶组成可溶性复合物(PAP复合物)。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体(第二抗体)，将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。

(三)双桥PAP法

在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未充分饱和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的Fc段结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测有实用价值。

(四)碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP法)

辣根过氧化物酶(HRP)是免疫组化的首选用酶，但有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了HRP的广泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。APAAP法就是用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。

四、酶免疫组化染色中常用的酶及显色底物

酶免疫组化技术中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺(DAB)，反应产物呈棕色;氨基乙基卡巴唑(AEC)，反应产物呈橘红色;4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。

碱性磷酸酶为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色。

其他标记酶还有葡萄糖氧化酶(G0)，β-半乳糖酶等，前者底物为葡萄糖，配以NBT和PMS，呈蓝色沉淀。