第十三章第一节概述

免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性和分子生物学技术的敏感性等巧妙地结合在一起，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。

免疫组织化学(简称免疫组化)技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金(银)组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术。

免疫组织化学的基本过程包括：

①抗原的提取与纯化;

②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化;

③将标志物与抗体结合形成标记抗体;

④标本的处理与制备;

⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应;

⑥观察结果

一、标本的处理

(一)标本的主要来源

1.活体组织;

2.各种体液、穿刺液;

3.培养细胞。

(二)标本的固定与保存

1.标本固定的目的;

2.固定剂的选择;

3.制片方法的评价;

冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

二、抗原的保存与修复

1.酶消化法;

2.盐酸水解法;

3.微波法;

4.高压锅法;

5.煮沸法。

三、抗体的处理与保存

(一)抗体的选择

选择抗体时应注意选择具有高度特异性和稳定的优质抗体，根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。

(二)抗体的稀释

抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。实际操作中需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度，以便达到最小背景染色下的最强特异性染色。

(三)抗体的保存

抗体是一种具有生物活性的蛋白质，在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。

四、免疫组化的结果判断

(一)对照的设立

设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。

(二)阳性结果

阳性细胞的显色分布有三种类型：①细胞质;②细胞核;③细胞膜表面。

(三)阴性结果及抗原不表达

阴性结果不能简单地认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性(只要是在抗原所在部位)也应视为阳性表达。

(四)特异性和非特异性显色的鉴别

1.特异性反应　常分布于特定抗原部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，具有结构性。非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。

2.非特异性反应　由于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。如果细胞之间显色强度相同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的着色，常提示为非特异性反应。

3.其他　在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显色同时存在，过强的非特异性显色背景可影响结果判断。

(五)免疫组化结果与HE切片结果

当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能简单地用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。

五、质量控制

(一)试剂的质量控制

抗体的质量是免疫组化染色技术成功的关键。使用前应了解第一抗体(即特异性抗体)和第二抗体(桥联抗体)的特异性和敏感性;通过预实验决定抗体的最佳稀释度;在已知阳性和阴性的标本上观察实验结果的符合情况。此外，试剂的质量控制还包括合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和时间等。

(二)操作步骤的质量控制

1.实验操作　需严格按照标准化操作步骤进行，关注日间和操作人员间的变异情况。此外还应包括对试剂的复溶及试剂的有效性进行质量控制。直接染色法可选择空白试验和替代试验;间接法、三步法可采用替代试验和吸收试验进行质量控制。

2.标本的质量控制　标本的留取、保存、固定和处理对免疫组化染色至关重要。用于质量控制的标本包括阴性、阳性或自身组织对照三种类型。质控品的设置可有助于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差。有时需要对标本进行前处理，以消除内源性过氧化物酶的干扰。

(三)技术设备、仪器和器具的质量控制

需定期对相关设备、仪器(含基本实验液体)和器具进行校准。操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行消毒，以减少对抗体污染的机会。