第一节　概述

发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性。发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级)，然后再返回到基态，并释放光子的过程。

光照发光、生物发光、化学发光

一、化学发光

化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光。化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光。

二、化学发光效率

化学发光反应的发光效率就是化学发光反应量子产率。

第二节　化学发光剂和标记技术

一、化学发光剂

在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。

(一)直接化学发光剂

在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用。

1.吖啶酯　在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N一甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。吖啶酯类发光剂可直接用于标记半抗原和蛋白质等。用于标记抗体时，结合稳定，结合后并不减少光量子的产生，可获得高的比活性，有利于双位点化学发光免疫分析的建立。

2.三联吡啶钌　三联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

(二)酶促反应发光剂

利用标记酶的催化作用，使发光剂(底物)发光。目前化学发光酶免疫分析中常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物。碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD。

1.鲁米诺及其衍生物 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物都有化学发光特性。鲁米诺是最早合成的发光物质。

2.AMPPD 是一种新的化学发光剂，其分子结构中有两个重要部分，一个是连接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子;另一个是磷酸基团，它维持着整个分子结构的稳定。

二、发光剂的标记技术

发光剂的标记是通过化学反应将发光剂连接到抗体或抗原上。标记反应分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。

(一)常用标记方法

1.碳二亚胺缩合法

2.过碘酸钠氧化法

3.重氮盐偶联法

4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法

(二)影响标记的因素

1.发光剂的选择

2.被标记蛋白质的性质

3.标记方法的选择

4.原料比

5.标记率

6.温度

7.纯化与保存