第三节酶联 免疫吸附试验

一、基本原理

1、把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2、将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性。

3、测定时将受检样品(含待测抗原或抗体)和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物。

4、用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

5、加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物，通过定性或定量检测有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

特点：由于酶催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。

二、方法类型及反应原理

三个必要的试剂：①固相的抗原或抗体;②酶标记的抗原或抗体;③酶反应的底物

抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法。

只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。

抗体测定：通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法等。

只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。

抗体测定：通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法等。

(一) 检测抗原的方法

属于非竞争结合测定，是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。

1、双抗体夹心法

双抗体夹心：固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物。

双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的较大分子抗原的测定，不能用于小分子半抗原的检测。临床上常用于乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等的检测。

2、双位点一步法

针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。

测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。

当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应(hook effect)，显色降低，严重时可出现假阴性结果。

3、竞争法

主要用于测定小分子抗原。

原理为先用抗小分子的特异性抗体包被固相，然后同时加入待测样本和酶标记的小分子，待测样本中的小分子与酶标小分子竞争与固相上的抗小分子的特异性抗体结合，温育一定时间后洗涤，加入酶底物显色。

竞争法的特点：

酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力。

反应体系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量(酶活性)与样品中非标记抗原的浓度成反比。

(二) 检测抗体的方法

1、间接法

检测抗体最常用的方法，属非竞争性结合试验。

将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体与固相载体上的抗原结合形成固相抗原一受检抗体复合物;加入酶标二抗，在固相上即形成固相抗原-待测抗体一酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。

间接法测抗体在目前应用最多的是丙型肝炎病毒抗体、人免疫缺陷病毒抗体和梅毒螺旋体抗体等的检测。

2、双抗原夹心法

临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。

3、竞争法

乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测。

4、捕获法　又称反向间接法。

主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。

如：甲型肝炎HAV-IgM抗体和乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体的检测、抗原、前列腺特异性抗原等)