第一节酶免疫技术的特点

酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。

它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。

在酶标抗体(抗原)与抗原(抗体)的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。

它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。

一、酶和酶作用底物

(一)酶的要求

1、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。

2、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。

3、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。

4、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。

5、酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。

(二)常用的酶

1.辣根过氧化物酶(HRP)

HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白(主酶)和亚铁血红蛋白(辅基)结合而成的复合物。

辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处;而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。

2.碱性磷酸酶(AP)

AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0;肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6;后一种AP的活性高于前者。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal)

β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。

(三)常用的底物

1.辣根过氧化物酶的底物

(1)邻苯二胺(OPD)

0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。

(2)四甲基联苯胺(TMB)ELISA中应用最广泛的底物。

(3)其他：5-氨基水杨酸(5-ASA)和2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)也是HRP常用的底物。

2.碱性磷酸酶(AP)的底物

常用对-硝基苯磷酸脂(p-NPP)，p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal)

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷(4-MUU)，酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮(4-MU)，其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。

二、酶标记抗体或抗原

酶标记抗体或抗原是指通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。

(一)酶标记抗体或抗原的制备

用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整(半抗原应先与大分子载体蛋白交联)。抗体则不仅需要特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还需要能批量生产和易予分离纯化。

目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的Ig组分、Ig的Fab'和F(ab')2片段等。

1、戊二醛交联法

戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法(如连接AP)，也可用二步法(如连接HRP)。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。其优点是酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。

2、改良过碘酸钠法

该酶含18%碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠(NaBH4)中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有人认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。此法酶标志物产率较高。

目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法。

(二)酶标志物的纯化

标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原。

常用的纯化方法有葡聚糖凝胶C-200/G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯。

(三)酶标志物的鉴定

质量鉴定包括酶活性和抗体(抗原)的免疫活性鉴定。

常用免疫电泳或双向扩散法，出现沉淀线表示酶标志物中的抗体(抗原)具有免疫活性。

沉淀线经生理盐水反复漂洗后一滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，则表示酶标志物中的酶活性仍保留。

三、固相载体

(一)固相载体的要求

结合抗体或抗原的容量大;可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落;不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。

(二)固相载体的种类和选择

1、塑料制品

抗体或抗原是以非共价或物理吸附方式结合到此载体上的。

2、微粒

此类载体正日渐普遍应用于自动化程序较高的荧光酶免疫测定和化学发光酶免疫测定等新技术中。

3、膜载体

有硝酸纤维素膜(Nc)、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

已广泛用于定性或半定量斑点ELISA的固相载体。

(三)包被与封闭

1、包被

将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。

2、封闭

需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除非特异性显色 ，此过程称为封闭。