第三节荧光免疫分析的类型

荧光免疫技术包括了荧光抗体技术和荧光免疫测定分析技术。荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。

一、时间分辨荧光免疫测定

时间分辨荧光免疫测定(TRFIA) 是一种非放射性核素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

(一)基本原理

1、时间分辨

2、Stokes位移

激发光谱和发射光谱的波长差。

镧系元素的荧光光谱Stokes位移较大，为273nm，很容易利用简单的滤光片进行波长分辨， 把激发光和发射光分开，消除激发光的散射(由样品池、溶剂分子和溶液中胶体颗粒引起)干扰。

3、发射光谱和激发光谱

镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光。

镧系元素激发光谱带较宽，为300～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。

4、荧光标志物的相对比活性

比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。

5、信号增强

(二)标志物和标记方法

1、标志物

用于时间分辨荧光免疫测定的标志物是镧系元素，最常用的是铕。

2、标记方法

镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原(或抗体)复合物。

(三)方法类型

1、双抗体夹心法

2、固相抗体竞争法

3、固相抗原竞争法

(四)方法评价

时间分辨荧光免疫测定灵敏度高;分析范围宽;标记结合物稳定，有效使用期长;测量快速，易自动化;无放射性污染，在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面都可与放射免疫分析媲美，为目前超微量物质分析最有发展前途的一项技术。缺点是易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使本底增高

二、荧光偏振免疫测定

荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。

(一)基本原理

当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光(蓝光，485nm)激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光(绿光，525～550nm)，偏振荧光有很强的方向性。

荧光偏振免疫测定常用异硫氰酸荧光素(FITC)标记小分子抗原。

(二)方法评价

荧光偏振免疫测定样品用量少;荧光素标记结合物稳定，使用寿命长;方法重复性好;快速，易自动化;试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质;灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。

三、荧光酶免疫测定

荧光酶免疫测定是利用酶标抗原(或抗体)与待检抗原(或抗体)反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。

(一)基本原理

以碱性磷酸酶(ALP)标记抗体(或抗原)，以固相载体包被抗原(或抗体)，以4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)为碱性磷酸酶反应的荧光底物，碱性磷酸酶分解4-MUP，脱磷酸根基团后形成4-甲基伞酮(4-MU)。4-MU经360nm激发光照射，发出450nm的荧光，通过荧光计数仪记录所产生的荧光强度，计算出待检抗原或抗体的含量。

(二)酶和荧光底物

用于荧光酶免疫测定标记的酶及荧光底物见表4-8-1，其中最常用的酶是碱性磷酸酶，最常用的荧光底物是4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)。

表4-8-1荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物

(三)方法类型

1、双抗体夹心法

2、双抗原夹心法

3、固相抗原竞争法

(四)方法评价

荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高

但血清和其他生物样品的背景荧光会干扰测定，因此用固相荧光酶免疫测定法效果好。