第二节荧光抗体技术

一、荧光抗体的制备

荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。

(一)抗体要求

将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。

用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。

(二)荧光素要求

实验室最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素。

(三)抗体的荧光素标记

1、搅拌法

2、透析法

(四) 荧光素标记抗体的纯化

1、透析法

2、层析法

(五) 荧光素标记抗体的鉴定

1、荧光素与蛋白质的结合比率

2、抗体效价

荧光抗体制备完成后应对其活性加以鉴定。可以采用双向免疫扩散试验测定抗体效价，抗原含量为1g/L时，抗体效价>1：16者较为理想。

3、抗体特异性

①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光。

②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，应受到明显抑制。

(六)荧光抗体的保存

荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光淬灭。最好小量分装，-20℃冻存可保存2～3年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。

二、标本的制作

常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。

三、荧光抗体染色与结果判断

(一)直接法

特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。

(二)间接法

可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体(荧光抗体)为针对第一抗体的抗抗体。

(三)双标记法

用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。

(四)荧光抗体染色结果判断

标本的特异性荧光强度一般用“+”号表示。“-”为无或仅见极微弱荧光;“+”为荧光较弱但清楚可见;“++”为荧光明亮;“+++”为耀眼的强荧光。临床上根据特异性荧光强度达“++”以上判定为阳性，而阴性对照应呈“-”或“±”。根据呈“+”“-”的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

四、荧光显微镜的基本结构

(一)光源

通常用高压汞灯、氛灯或卤素灯作为激发光源。

(二)滤光片

滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。

(三)光路

分为透射光和落射光两种形式。

(四)聚光器

聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。

(五)镜头

目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。