第一节放射免疫技术

放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。

早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。

一、基本类型及原理

1.放射免疫分析(RIA)

是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。

2.免疫放射分析(IRMA)

是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。

二、常用的放射性核素

放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。使用最广泛的是125Ⅰ。

三、标志物制备及鉴定

采用放射性碘(如125Ⅰ)制备标志物的基本原理是以放射性碘原子通过取代反应置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。

(一)标记及类型

1.直接标记法

最常用于肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其原理是采用化学或酶促氧化反应直接将125Ⅰ结合于被标志物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。

其特点是标记方法操作简便，容易将较多的125Ⅰ结合到被标记蛋白分子上，易得到比放射性较高的标志物。常用的方法为：①氯胺T(ch-T)法;②乳过氧化物酶标记法。

2.间接标记法

也称连接标记法(Bolton-Hunter法)，是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。

纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标志物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)以及高效液相色谱法。

(二)标志物的纯化

125Ⅰ标志物反应后，标志物需进行分离纯化以去除游离125Ⅰ和其他杂质。纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标志物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)以及高效液相色谱法。

(三)标志物的鉴定

1.放射化学纯度

是指单位标志物中结合于被标志物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。

2.免疫活性

指制备的标志物与抗体结合的能力。

3.比放射性

指单位化学量标志物中所含的放射性强度，也可理解为每分子被标志物平均所结合放射性原子数目，常用Ci/g、mCi/mg或Ci/mmol等单位表示。比放射性计算方法有计算法和自身置换法。

四、抗血清鉴定

抗血清的质量直接影响分析方法的特异性和灵敏度。用于鉴定抗血清质量的参数主要有以下几项：

1.亲和性

是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度，常用亲和常数Ka表示。

2.特异性

是指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力。

3.效价

是反映抗血清中有效抗体含量的相对参数，即抗血清稀释至能与抗原发生有效反应的最大稀释度。

五、方法学评价

为增强结果的可比性，需对RIA方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：

1、可靠性

2、剂量-反应曲线

3、高剂量钩状效应