第三节凝胶内沉淀试验

凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。

凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。

一、单向扩散试验

单向扩散试验是在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。

(一)试管法

将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。

(二)平板法

将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48小时后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。

1、Mancini曲线 适用大分子抗原和长时间扩散(>48小时)的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。

2、Fahey曲线 适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数值画线,浓度对数与扩散环直径呈线性关系。

(三)影响因素

1、抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。

2、每次测定都必须作标准曲线。

3、每次测定时必须用质控血清作质控。

4、注意双环现象(出现了两种抗原性相同成分) 。

5、应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低;用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。

二、双向扩散试验

双向扩散试验是让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。

(一)试管法

(二)平板法

是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一

先在平板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固后在琼脂板上打孔，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃ 18～24小时后,琼脂中各自扩散的抗原和相对应的抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。

1、抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计。

沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大。

沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大。

不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。

2、抗原或抗体相对分子量的分析

抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。

分子量小者扩散快，反之则较慢。

由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。

如果两者分子量大致相等，则形成直线。

3、抗原性质的分析

两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同。

沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同。

两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。

4、抗体效价的滴定

双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。

固定抗原的浓度，稀释抗体。

或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。

5、抗原或抗体纯度鉴定

出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯。

出现多条沉淀线说明不纯。