4.(2016·江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 识别序

列及切

割位点

图1

图2

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。

(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________________________________________________________。

(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。

(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。

解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2+处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c;考虑只切1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为a+b+c;考虑切2个切割位点，则会产生a+b、c、a+c、b、b+c、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a+b+c、a+b、a+c、b+c、a、b、c。

答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　连接　感受　(2)四环素　引物甲和引物丙　(3)

都不能　(4)7

5.多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶，使细胞壁破损。成熟的番茄果实PG的合成量显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程的方法减少PG基因的表达，可延长番茄的保质期。科学家将PG基因接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄。请回答下列问题：

(1)转基因番茄的培育过程中涉及的工程手段所依据的生物学原理是______________________________。对该农产品进行销售时需进行标注，以维护消费者对转基因产品的__________和__________。一些消费者担心转基因番茄的安全性，主要表现在________________________________________________________________________

(至少答出一点。)

(2)将PG基因接到Ti质粒上，属于基因工程操作流程中的________________________________________________________________________。

(3)将含有目的基因的番茄细胞培育成转基因番茄植株，需经过____________和____________的过程。若想获得转基因番茄的人工种子，需以植物组织培养得到的______________________________________等为材料，经过人工薄膜包装而得到。

解析：(1)转基因番茄的培养过程用到的工程手段有基因工程和植物细胞工程，应用的原理分别是基因重组和植物细胞的全能性;我国的《基因工程安全管理办法》是为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权。一些消费者认为不能对转基因食品的安全性掉以轻心，主要表现在担心出现滞后效应、担心出现新的过敏原、担心营养成分的改变等。(2)将PG基因接到Ti质粒上，属于基因工程的核心步骤，即基因表达载体的构建。(3)植物组织培养过程需经过脱分化和再分化过程。所谓人工种子，就是以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。

答案：(1)基因重组和植物细胞的全能性　知情权　选择权　担心出现滞后效应(或担心出现新的过敏原、担心营养成分改变等)　(2)基因表达载体的构建　(3)脱分化　再分化　胚状体、不定芽、顶芽和腋芽

考点二 克隆技术 6.研究小组用土壤农杆菌与陆地棉叶肉细胞原生质体共同培养获得了转基因陆地棉，过程如下。请回答下列问题：

(1)图a表示从已经消毒的叶片中剪取部分植物组织细胞，图b表示制备原生质体，培养皿中要加纤维素酶和果胶酶，其原因是_____________________________________________。

(2)图c表示用培养基培养原生质体，培养基中加入了适宜浓度的蔗糖，其主要作用是_____________________和__________________。培养一段时间后，将其与土壤农杆菌混合培养，使重组Ti质粒进入________________，重组Ti质粒上______________段携带了目的基因，可以整合到植物细胞的 __________________上。然后通过离心(图d)的方法，除去多余的土壤农杆菌。

(3)图e表示将原生质体培养成愈伤组织，然后将其转移到含有一定抗生素的培养基中进行培养(图f)，抗生素的作用是_______________________________。

(4)将愈伤组织转移培养基继续培养(图g)，同时注意调整植物生长调节剂的种类和含量，其原因是______________________________________，最终获得完整的植株(图h)。

解析：图示是通过土壤农杆菌与植物细胞原生质体共培养的方法获得转基因植物的过程。a为获取植物细胞;b为去除细胞壁获取原生质体的过程;c为用培养基培养原生质体;d为土壤农杆菌与植物细胞原生质体共培养;e表示脱分化过程;f表示用选择培养基进行筛选培养;g表示再分化过程;h表示转基因植物幼苗。(1)图b表示用纤维素酶和果胶酶两种酶来制备原生质体，原因是植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，纤维素酶和果胶酶可除去细胞壁。(2)图c表示用培养基培养原生质体，培养基中加入了适宜浓度的蔗糖，其主要作用是为原生质体提供碳源和能源和调节渗透压维持原生质体的形态，将其与土壤农杆菌共同培养，使携带目的基因的Ti质粒的T­DNA进入植物细胞，整合到植物细胞的染色体(染色体DNA)上，然后通过离心的方法，除去多余的土壤农杆菌。(3)图e表示将原生质体培养成愈伤组织，然后将其转移到含有一定抗生素的培养基中进行培养(图f)，抗生素的作用是筛选出含目的基因的植物细胞。(4)植物生长调节剂的种类和含量会影响愈伤组织的分化，故将愈伤组织转移培养基继续培养(图g)，同时注意调整植物生长调节剂的种类和含量。

答案：(1)植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，纤维素酶和果胶酶可除去细胞壁　(2)为原生质体提供碳源和能源　调节渗透压维持原生质体的形状　原生质体(植物细胞)　T­DNA　染色体(染色体DNA)　(3)筛选出含目的基因的植物细胞　(4)植物生长调节剂的种类和含量会影响愈伤组织的分化