第三节 病毒学诊断

　　一、标本的采集与送检(principle of collection specimen)：1 早期(前驱期、急性期、发病前1~2天)2 根据不同病毒感染，采集不同部位标本3 病毒易被灭活(细胞内寄生，怕热不怕冷)，低温保存，快速送检4 标本无菌采集与处理(加抗生素，除菌并防止污染)5 血清学实验检查抗体(双分血清)

　　二、病毒的分离培养与鉴定(virus isolation and determination)

　　(一)病毒的分离

　　方法：1.动物接种(选择易感动物及接种部位，观察发病情况) 2.鸡胚培养(不同病毒选择不同接种部位(绒毛尿囊膜，尿囊腔，羊膜腔，卵黄囊)，分离流感病毒最常用。)

　　细胞培养：分离病毒最常用的方法：

　　(1)原代细胞来源于动物、鸡胚、人胚组织细胞，对多种病毒敏感，但只能传2-3代。

　　(2)二倍体细胞在体外分裂50-100代后仍保持2倍体染色体数目的单层细胞。

　　(3)传代细胞能在体外无限传代的细胞多由癌细胞或二倍体细胞突变而来。

　　病毒在培养细胞中增殖的指标

　　1.细胞的变化：(1)出现细胞病变效应(CPE)：即某些病毒在细胞内增殖引起的特有的细胞病变(细胞变圆、聚集、坏死、脱落等)(2)形成细胞融合(多巨核细胞)(3)形成包涵体：某些病毒在细胞浆或核内增殖后形成的嗜酸或嗜碱性的团块状结构。(病毒增殖场所)2.红细胞吸附3.干扰现象4.细胞代谢改变(pH)

　　(二)病毒的数量与感染性测定：1.红细胞凝集试验2.中和试验 3.空斑形成试验 4.50%组织细胞感染量测定 5.病毒复数测定

　　三、病毒感染的血清学诊断：用已知病毒抗原检测病人血清中相应抗体以诊断病毒性疾病(中和实验、补体结合实验、血凝抑制实验、凝胶免疫扩散等)。

　　四、病毒感染的快速诊断

　　(一)形态学 ： 1.电镜和免疫电镜直接观察病毒 2.光镜 大病毒和包涵体

　　(二)检测病毒蛋白抗原：用已知特异性抗体直接检测病毒蛋白抗原(简便、敏感、特异)

　　常用方法：1.免疫荧光技术(IF)2.固相放射免疫测定(SPRIT)3.酶免疫技术(EIA)等。

　　(三)检测病毒特异性IgM抗体：检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染或证明病毒复制。

　　(四) 检测病毒核酸

　　1 核酸杂交：①斑点杂交(dot hybridization)②原位杂交(in site hybridization)③DNA印迹杂交(Southern blot)④RNA印迹杂交 (northern blot)

　　2 核酸扩增：①聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR DNA)②连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)③反转录PCR(Reverse transcrptase PCR，RTPCR (RNA)