第十九章 免疫学检测技术

　　一、血清学技术

　　血清学反应是指在体外进行的抗原抗体结合反应，相关的技术称为血清学技术。

　　(一)沉淀反应

　　可溶性性抗原和相应特异性抗体以合适的比例结合，在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应。单向免疫扩散、双向免疫扩散、对流免疫电泳、免疫电泳均为沉淀反应。

　　1.单向免疫扩散 制备含特异性抗体的琼脂板。在适当的位置打孔，加相应抗原于孔内。抗原自小孔向四周琼脂中扩散，在适当的位置形成环状的沉淀线。环的直径和抗原的浓度呈正相关。此法常用于人或动物血清免疫球蛋白和补体成分的测定。

　　2.双向免疫扩散 在琼脂板上按一定距离打孔。在相邻的两孔中分别加入抗原和抗体。抗原和抗体在琼脂中扩散，当二者相对应时，可在两孔间的适当位置形成由免疫复合物组成的沉淀线。此法常被用于抗原或抗体的定性。

　　3.对流免疫电泳 将两端各打一排孔的琼脂板置电泳槽中，在阴极一侧的孔中加抗原，阳极一侧孔中加抗体，通电使抗原抗体分子泳动，当二者相对应时，可于一定时间后在两排孔之间形成沉淀线。对流电泳是电场作用下的双向免疫扩散。

　　4.免疫电泳 先将待测抗原样品做琼脂糖凝胶电泳，使不同的组分依电泳速度不同而分散开。然后在样品泳道一侧的适当距离处挖一和泳道平行的直线沟槽。于槽内加入已知抗体(一种或多种)。让抗原和抗体进行双向免疫扩散，在泳道和槽的中间形成沉淀线。此法可用于免疫球蛋白缺乏或增多疾病的诊断和鉴别诊断。

　　(二)凝集反应

　　颗粒性抗原(细菌、红细胞、偶联抗原的乳胶颗粒)与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，此称为凝集反应。

　　1.直接凝集 直接凝集是颗粒性抗原(细菌、红细胞)与相应抗体结合产生的凝集反应。利用直接凝集可鉴定细菌和血型。

　　2.间接凝集 将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后，与相应抗体或抗原作用出现的凝集。采用红细胞为载体的间接凝集称间接血凝。采用乳胶颗粒为载体的凝集称为乳胶凝集。以包被抗原检测抗体的间接凝集称为正向间接凝集。以包被抗体检测抗原的间接凝集称为反向间接凝集。

　　用此法可检测乙型肝炎表面抗原和甲胎蛋白等。

　　二、免疫标记技术

　　(一)免疫荧光

　　免疫荧光技术是用荧光素标记的抗体或(抗原)分子检测相对应的抗原或抗体分子的技术。

　　1.直接荧光法 把荧光素标记的抗体与待检标本(细胞悬液、细胞涂片或组织切片)相互作用，洗去未结合荧光标记抗体，在荧光显微镜下观察，有荧光的部位为阳性。

　　2.间接荧光法 将特异性抗体(一抗)和待检标本(细胞悬液、细胞涂片或组织切片)相互作用后，加入荧光索标记的一抗的抗体(二抗)显示结果。

　　免疫荧光法在病原体的诊断、细胞表面标志的鉴定等方面用途广泛。流式细胞仪(FACS)是用于分离、鉴定荧光素标记单克隆抗体识别细胞的仪器。

　　(二)放射免疫分析

　　根据竞争结合原理，应用放射性核素标记的抗原与相应的抗体(抗原)结合，通过抗原抗体复合物的放射性活性判断结果称放射免疫分析。该方法最敏感。

　　1.液相法 将待检标本(含抗原)与定量的放射性核素标记的已知抗原和定量的特异抗体混合，经一定时间的作用后，分别测定免疫复合物和游离部分的放射性。根据用非标记抗原作成的标准曲线，可确定待检样品中相应抗原的含量。

　　2.固定法将吸附到固相载体表面的抗原与待检标本(含抗体)作用，然后加标记抗体。测定结合于固相载体的放射性，判定结果。

　　放射免疫分析法在激素、药物、抗体、维生素的测定等方面应用广泛。

　　(三)酶免疫分析

　　1.免疫酶染色 酶标抗体和抗原(如组织切片上的抗原)发生特异性结合后，加入酶底物。底物在酶的催化下生成有色的物质。

　　2.酶联免疫吸附实验(ELISA)

　　(1)间接法：将已知的抗原包被在固相载体的表面，加入待检标本(含特异性抗体)，再加入酶标记抗Ig抗体(第二抗体)。加底物显色，根据颜色的光密度判定标本中抗体的含量。

　　(2)夹心法：将已知的特异性抗体包被在固相载体表面，加入待检标本(含抗原)，标本中的抗原和包被的抗体结合。冲洗后，加入该抗原的酶标抗体，加底物显色。根据颜色的光密度判定标本中抗原的含量。

　　3.ELISPOT测定法 用某种细胞因子的抗体包被固相载体(如96孔板)，加入待检细胞，经孵育后，如待检细胞分泌了细胞因子，这些因子被包被的抗体捕获。洗去细胞，加细胞因子特异性抗体。洗去未结合抗体。加酶标抗体，洗去未结合抗体。加底物显色后，可出现有颜色的斑点。根据斑点的数量可判定细胞因子分泌细胞的数量，根据斑点的深浅，也可判定此细胞因子的相对含量。

　　(四)化学发光物质标记技术

　　用化学发光物质(如鲁米诺)标记的抗原或抗体进行抗体或抗原检测的方法。其结果用发光光度计来检测。

　　(五)免疫印迹试验

　　将抗原物质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分带后转至硝酸纤维素膜上，用酶标或放射性核素标记的抗体识别和结合抗原，加底物显色或做放射自显影显示结果。该法能测定待检蛋白质的分子量和特异性。应用该法检测血清中的HIV抗体是确认HIV感染的方法。