1.(2013·四川卷，10)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。

(1)图甲中，过程①需要的酶有________________________________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以________作为唯一碳源。②、③过程需重复几次，目的是____________________________。

(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是______________;推测该同学接种时可能的操作失误是______________。

(3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是________________________________________________________________________。

(4)用凝胶色谱法分离α淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。

答案　(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶　淀粉　进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌　(2)稀释涂布平板法　涂布不均匀　(3)工程酵母　工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO2的速率更快

(4)小

解析　(1)图甲中过程①为构建基因表达载体，需要的酶有限制性核酸内切酶及DNA连接酶;欲筛选可直接利用淀粉的菌种，宜制备以淀粉为唯一碳源的选择培养基;图示②、③过程需重复几次，其作用在于“纯化”，从而进一步筛选出分解淀粉能力更强的酵母菌。(2)图乙所示培养基平板中的菌落呈分散分布，应为采用稀释涂布平板法接种的结果，然而，该平板上菌落并非“均匀分布”而是相对集中于左侧，这可能是由于制作平板时“涂布不均匀”所致。(3)若以“淀粉”为原料，则相对于普通菌种，工程酵母菌因转入了α淀粉酶基因，其利用淀粉的能力将更强，故发酵产生CO2的能力更强，因此需要先排气。(4)凝胶色谱法分离蛋白质的原理是相对分子质量较小的分子，能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。

2.请回答下列生物技术方面的问题：

(1)测定亚硝酸盐含量的操作程序是：①配制溶液;②______________________________;③______________________;④比色。

泡菜发酵过程中产生的亚硝酸盐在盐酸酸化条件下，与对氨基苯磺酸的反应产物能与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶联成________色化合物。

(2)为获得一种能高效降解农药的细菌(目的菌)，向培养基中加入某种化合物，将初步筛选得到的目的菌转到固体培养基中，常采用的接种方法是______________;实验结束后，使用过的培养基应该进行处理后再倒掉，这样做是为了____________________________。

(3)研究发现，固定化强度强的酵母颗粒发酵效果好，且稳定性高、使用寿命长。某机构利用上述装置，将2%、2.5%、3%的海藻酸钠分别利用2%、3%、4%的X溶液进行凝胶化处理，所得到的固定化酵母颗粒的强度及在28 ℃下发酵48 h 后的酒精产量见下表：

海藻酸钠(%) 2 2.5 3 2 2.5 3 2 2.5 3 X溶液(%) 2 2 2 3 3 3 4 4 4 固定化强度(g/30个) 930 950 990 1 030 1 100 1 140 1 170 1 170 1 160 酒精量(%) 6.7 6.5 6.5 6.7 6.4 6.2 6.7 6.4 6.3 由表格内容可以看出，随着X溶液浓度的增加，________________增加;凝胶固定化效果较好和酒精产量较大的海藻酸钠与X溶液浓度分别是________、________。

答案　(1)制备标准显色液　制备样品处理液　玫瑰红　(2)平板划线法　防止造成环境污染　(3)固定化强度　2%　4%

解析　在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。常用的接种方法有两种，平板划线法和稀释涂布平板法;一般来讲在固体培养基上直接进行纯化的，需要用平板划线法;用液体培养基培养后再纯化的，需要稀释涂布平板法。实验结束后，使用过的培养基应该进行处理后再倒掉，这样做是为了防止致病微生物威胁人体健康和对环境的污染。固定化细胞操作更容易，对酶活性影响更小，且能更新，容易回收，可连续性生产，成本自然更低。

3.从自然菌样中筛选理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样→选择培养→纯种分离→性能测定。

(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。若培养噬盐菌的菌样应从____________环境中采集。

(2)选择培养指创设特定环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然菌样中分离到所需特定微生物的培养方法。人们对富含耐高温淀粉酶的微生物选择培养应选择以____________为唯一碳源的选择培养基，并在________条件下培养。

(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的________________等物质发生变性。________灭菌法是微生物研究中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。

(4)下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在图乙中画出第三次划线。划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是__________________。

(5)植物组织培养过程中也要十分注意灭菌及避免被杂菌污染。在配制好的MS培养基中，若要促进愈伤组织的生长，需要进行的处理是__________________________。

答案　(1)高盐　(2)淀粉　高温　(3)蛋白质和核酸　高压蒸汽　(4)如右图　避免水滴污染培养基　(5)添加比例适中的生长素和细胞分裂素

解析　(1)嗜盐菌就生活在高盐环境中，如海滩等环境。(2)耐高温淀粉酶应存在于以淀粉为唯一碳源且在高温环境中生存的微生物体内。(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生变性，高压蒸汽灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)每划一个新区域前都要对接种针进行灭菌处理。(5)培养基配制时应先溶化，再调整pH值，然后灭菌。添加比例适中的生长素和细胞分裂素可促进愈伤组织的生长。

4.下图为某工厂设计的芦柑加工工艺流程，请分析回答：

(1)为提高出汁率，过程②可使用________酶处理，该酶是一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、__________________酶，为提高该酶的利用率常采用________技术;过程③常常接种的菌种是________，并且需要严格控制氧分压。

(2)芦柑果皮可用来提取香精油，过程④最好采用的方法是________法。为提高出油率，材料需经过石灰水________处理，然后漂洗。

(3)现获得一株无子突变芦柑，研究人员要在较短时间内获得大量突变植株，最好采用______________的方法，该过程中需要对外植体进行________处理。在上述过程中，所用到的培养基及器材都需要严格灭菌，工作台需要用__________擦拭。培养基中除基本营养成分之外，还需要添加____________。

答案　(1)果胶　果胶分解酶和果胶酯　固定化酶　酵母菌

(2)压榨　浸泡　(3)植物组织培养　消毒　70%的酒精　植物激素

解析　果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清;工业上为提高该酶的利用率常采用固定化技术;植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等，过程④最好采用的方法是压榨法;要在较短时间内获得大量突变植株，最好采用植物组织培养的方法。